酶法与碱法联合催化高酸值鱼油乙酯化的研究

酶法与碱法联合催化高酸值鱼油乙酯化的研究

邵佩霞1，马永钧2，王卫飞1，王永华1，杨 博3

(1.华南理工大学 轻工与食品学院，广州 510640； 2.浙江兴业集团有限公司，浙江 舟山316101； 

3.华南理工大学 生物科学与工程学院，广州510640)

摘要：以高酸值鱼油为原料，采用酶法与碱法联合催化鱼油进行乙酯化反应。首先以脂肪酶为催化剂，催化鱼油与乙醇酯化反应降低原料酸值，得到优化的反应条件为：底物鱼油与无水乙醇的摩尔比为1∶ 1，脂肪酶Novozym 435加量为鱼油质量的2%，反应温度45 ℃，恒温振荡器转速为180 r/min，反应时间6 h。在此优化条件下，鱼油酸值（KOH）从10.20 mg/g降至0.67 mg/g，再以氢氧化钠为碱催化剂，催化鱼油进行进一步乙酯化反应，反应1.5 h后乙酯产率达到96.5%。

关键词：酶法；碱法；鱼油；高酸值；脂肪酸乙酯

中图分类号：TQ645；TS218   文献标志码：A   文章编号：1003－7969(2010)09－0029－04

Ethyl esterification of high-acid fish oil catalyzed by combination of 

enzyme and alkali

SHAO Peixia1,MA Yongjun2 ,WANG Weifei1,WANG Yonghua1, YANG Bo3

(1.College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, 

Guangzhou 510640,China; 2.Zhejiang Industrial Group Co. , Ltd. , Zhoushan 316101,

Zhejiang,China; 3.School of Bioscience and Bioengineering,South China

University of Technology, Guangzhou 510640,China)

Abstract：The ethyl esterification of fish oil with high acid value was catalyzed by combination of enzyme and alkali. First, lipase was used to catalyze the reaction of fish oil and ethanol to decrease the acid value of fish oil, and the optimal conditions were obtained as follows: molar ratio of fish oil to anhydrous ethanol 1∶ 1, the amount of lipase Novozym 435 2%(based on the mass of fish oil), reaction temperature 45 ℃, oscillator speed 180 r/min, reaction time 6 h.Under the optimal conditions, the acid value of fish oil fell to 0.67 mgKOH/g from 10.20 mgKOH/g. And then sodium hydroxide was used as the alkaline catalyst for the further ethyl esterification, the yield of ethyl esters was 96.5% after reaction for 1.5 h. 

Key words：enzymatic method; alkaline method; fish oil; high acid value; fatty acid ethyl esters

    二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）具有降血脂，防治心脑血管疾病，增强神经系统功能，益智健脑，增强免疫力，抑制肿瘤生长，保护视力等生理功能［1-6］。EPA和DHA主要来源为深海鱼油，天然鱼油中EPA和DHA含量较低，一般将其转化成脂肪酸乙酯的形式，然后经过分子蒸馏或尿素包合等工艺进行浓缩。鱼油乙酯化方法按催化剂不同可分为酸催化法、碱催化法和脂肪酶催化法［7］。传统的乙酯化工艺是将鱼油在酸或碱的催化下与乙醇酯交换反应转化成脂肪酸乙酯。而脂肪酶催化法由于乙酯化程度不理想，催化剂成本较高，尚未实现工业化应用［8］。相对于酸法乙酯化，鱼油的碱法乙酯化具有反应速度快、得率高、产品品质好等优点，但碱法乙酯化不适用于酸值较高的鱼油。在碱催化鱼油乙酯化反应过程中，鱼油游离脂肪酸含量必须尽可能低(酸值（KOH）小于1 mg/g)［9,10］，否则会因为碱和游离脂肪酸发生皂化反应，而影响酯化反应的进行，而且易造成鱼油乙酯和皂分离困难，使反应得率大大降低。

    脂肪酶广泛用于油脂改性与加工，如功能性油脂的合成［11］和油脂酶法脱酸［12］等。本文利用酶法与碱法联合催化鱼油乙酯化，先以脂肪酶催化高酸值鱼油与乙醇的酯化反应，降低其酸值；然后利用碱法催化乙酯化反应提高产品得率及品质。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂

    原料鱼油，浙江舟山新诺佳生物工程有限公司提供；脂肪酶Novozym 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM，丹麦Novozymes公司提供。

1.2 主要仪器、设备

    Agilent 7890A气相色谱仪，Waters 2695高效液相色谱仪，RH KT/C加热磁力搅拌器（德国IKA），SHZ-D循环水式真空泵，RE-52A旋转蒸发器，THZ-C恒温振荡器。

1.3 分析方法

1.3.1 鱼油酸值测定 按GB/T 5530—2005 动植物油脂 酸值和酸度测定。

1.3.2 鱼油脂肪酸组成分析 将鱼油样品进行甲酯化［11］后用气相色谱进行脂肪酸分析。检测条件为：色谱柱CP-Sil 88（60 m × 0.25 mm×0.2 μm）。升温程序：150 ℃保持3 min；5 ℃/min升温至175 ℃，保持5 min；10 ℃/min升温至215 ℃，保持22 min。进样口温度250 ℃，检测器温度300 ℃。载气N2，燃气H2，助燃气为空气。

1.3.3 鱼油乙酯化产率的测定 鱼油乙酯化反应产物组成由高效液相色谱检测得出。检测条件为：Waters 2414示差折光检测器；LUNATM硅胶色谱柱（250 mm×4.6 mm ×5 μm）；柱温30 ℃；流动相为V（正己烷）∶ V(异丙醇)=50∶ 1；流速1.0 mL/min。乙酯产率计算公式如下：

     乙酯产率=A1/(A1+A2)×100%

式中：A1——乙酯的色谱峰面积，mV·s；

A2——甘油酯的色谱峰面积，mV·s。

1.4 试验方法

1.4.1 鱼油毛油预处理 称取一定量的鱼油于抽滤瓶中，置于加热磁力搅拌器上，加入1%的白土、0.5%的活性炭。在一定的真空度下加热到70 ℃(±2 ℃),并开始计时，保温搅拌30 min后将油温降至室温，抽滤除去吸附剂后待用。

1.4.2 脂肪酶催化鱼油与乙醇的乙酯化反应 取一定量的鱼油，加入无水乙醇和脂肪酶，置于旋转式恒温振荡器中反应，定时取样检测酸值。反应结束后过滤除去脂肪酶，真空条件下脱去水和乙醇，反应产物作为下一步碱催化反应的底物待用。

1.4.3 碱催化鱼油与乙醇的乙酯化反应 以 1.4.2反应中优化条件后的反应产物为底物。将氢氧化钠和无水乙醇按一定比例加入干燥的三颈平底烧瓶中，置于75 ℃的恒温磁力搅拌器上，加热搅拌开始回流，待氢氧化钠溶解后加入适量反应底物，密闭容器进行乙酯化反应。定时取样分析反应产物组成。

2 结果与讨论

2.1 鱼油EPA、DHA含量的测定

    鱼油的脂肪酸组成和品质特征是判断鱼油是否具有深加工价值的重要指标，原料鱼油和预处理鱼油的EPA、DHA含量和酸值如表1所示。

表1 预处理前后鱼油EPA、DHA含量及酸值

    由表1可见，本研究所选用的原料鱼油中EPA和DHA的总含量为32.11%，可作为提纯多不饱和脂肪酸的原料，其中DHA含量较高，EPA含量略低，可用于生产富含DHA的鱼油产品，以供添加于妊娠妇女、婴幼儿和老年痴呆症患者食品中。

2.2 脂肪酶催化高酸值鱼油与乙醇的反应

2.2.1 不同脂肪酶对鱼油酸值的影响 选用3种常用固定化脂肪酶Novozym 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM ，分别考察3种酶在催化高酸值鱼油乙酯化过程中对鱼油酸值的影响。反应在45 ℃恒温振荡器中进行，转速为180 r/min，底物鱼油（相对分子质量以甘油酯计，下同）与无水乙醇的摩尔比为1∶ 2，脂肪酶加量为鱼油质量的2%，其结果如图1所示。

图1 不同脂肪酶对鱼油酸值的影响

    由图1可见，3种脂肪酶催化高酸值鱼油与乙醇反应时对鱼油酸值的影响存在明显差异。其中采用脂肪酶Novozym 435为催化剂的反应酸值下降最显著，反应1 h后鱼油酸值从10.20下降至6.25，反应6 h后下降至0.93。以脂肪酶Lipozyme RM IM为催化剂时，反应初期鱼油酸值有一定程度的下降，6 h后酸值降至4.78；但随着反应时间的延长酸值有所回升，主要原因可能是反应后期油脂水解反应加剧，导致体系中游离脂肪酸增加。以脂肪酶Lipozyme TL IM为催化剂时，鱼油酸值下降速度非常缓慢，反应6 h后酸值只降至9.30。因此，脂肪酶Novozym 435是适用于该反应体系的催化剂。

2.2.2 底物摩尔比对鱼油酸值的影响  鱼油与乙醇摩尔比分别为1∶ 0.3、1∶ 0.6、1∶ 1、1∶ 2时考察不同底物摩尔比对鱼油酸值的影响。反应在45 ℃恒温振荡器中进行，转速为180 r/min，脂肪酶Novozym 435的加量为鱼油质量的2%，其结果如图2所示。

图2 底物摩尔比对鱼油酸值的影响

    由图2可以看出，反应前期（2 h前），乙醇的添加量越小，鱼油酸值下降越快。当鱼油与乙醇摩尔比为1∶ 0.3和1∶ 0.6时，由于反应体系中乙醇浓度较低，随着反应时间的延长乙醇被逐渐消耗，水解反应加剧使酸值迅速回升。鱼油与乙醇摩尔比为1∶ 1时，反应6 h后鱼油酸值降至0.67，脱酸效果理想，原因可能是增加反应体系中乙醇的浓度能够增加底物分子之间的碰撞机会，促进反应的进行，反应后期酸值缓慢上升，因此应控制反应时间在6 h左右较好。鱼油与乙醇摩尔比为1∶ 2时，酸值下降较缓慢，原因可能是大量的乙醇对酶产生毒性，从而影响酶的催化活力。因此，选取鱼油与乙醇摩尔比为1∶ 1，反应6 h较适宜。

2.2.3 反应温度对鱼油酸值的影响 反应温度分别为35、45、55 ℃时，考察不同温度对酶催化鱼油乙酯化反应中鱼油酸值的影响。酶反应在恒温振荡器中进行，转速为180 r/min，底物鱼油与无水乙醇的摩尔比为1∶ 1，脂肪酶Novozym 435的加量为鱼油质量的2%，其结果如图3所示。

图3 反应温度对鱼油酸值的影响

    由图3可知，反应前期（3 h前），反应温度越高鱼油酸值下降速度越快；反应4 h后，反应体系温度较高时（55 ℃），酸值开始明显回升，原因可能是温度过高容易使反应体系中的乙醇挥发损失。因此,选择反应温度为45 ℃为宜。

2.2.4 酶加量对鱼油酸值的影响 脂肪酶Novozym 435加量分别为1.5%、2%、2.5%、3%时，考察不同酶加量对催化过程中鱼油酸值的影响。反应在45 ℃恒温振荡器中进行，转速为180 r/min，底物鱼油与无水乙醇的摩尔比为1∶ 1，结果如图4所示。

图4 酶加量对鱼油酸值的影响

    在酶催化反应中，酶加量对反应速度有重要影响。由图4可以看出，随着酶加量的增加，鱼油酸值下降速度加快。但酶加量超过2%时，继续增大酶加量酸值下降缓慢，说明此时增加酶加量对鱼油酸值的影响并不显著，而且酶加量增加会导致成本的增加。综合考虑，反应中选取最佳的酶加量为2%。

2.3 碱催化制备鱼油脂肪酸乙酯

    根据以上脂肪酶催化试验结果，选取以下条件进行酶催化反应：底物鱼油与无水乙醇的摩尔比为1∶ 1，脂肪酶Novozym 435加量为鱼油质量的2%，反应温度45 ℃，恒温振荡器转速为180 r/min，反应时间6 h。反应结束后过滤除去脂肪酶，真空条件下脱去水和乙醇，反应产物作为碱催化反应的底物。碱催化反应制备鱼油脂肪酸乙酯的条件：底物鱼油与无水乙醇的摩尔比为1∶ 6，氢氧化钠用量为鱼油质量的0.3%，反应温度75 ℃［13］，其产物乙酯产率如图5所示。

图5 碱催化鱼油乙酯化过程曲线

    酶催化反应产物中有22.1%的鱼油乙酯并且游离脂肪酸含量较低（酸值(KOH)0.67 mg/g），说明酶反应过程中大部分游离脂肪酸被消耗，并且有部分甘油酯参与乙酯化反应。由图5可知，碱催化鱼油乙酯化能够显著提升乙酯的产率。此条件下反应1.5 h鱼油乙酯产率达到96.5%。而且在此温度下反应，由于反应时间较短，鱼油中多不饱和脂肪酸无氧化迹象。

3 结 论

    以高酸值鱼油为原料，经预处理后，首先利用脂肪酶为催化剂，催化鱼油与乙醇反应降低原料酸值。对酶催化反应条件进行了优化，得到的酶反应条件为：以脂肪酶Novozym 435为催化剂，底物鱼油与无水乙醇的摩尔比1∶ 1，脂肪酶加量为鱼油质量的2%，反应温度45 ℃，恒温振荡器转速为180 r/min，反应时间6 h。在优化条件下，鱼油酸值(KOH)从10.20 mg/g降至0.67 mg/g，有利于碱催化法对鱼油进行进一步乙酯化。碱催化鱼油乙酯化是比较成熟的工艺，本研究中以酶催化产物为碱催化乙酯化的底物，以氢氧化钠为催化剂，添加量为鱼油质量的03%，反应1.5 h后乙酯的产率达到96.5%。

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