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真菌油脂含量快速测定方法

发布日期:2019-04-04 作者: 点击:

真菌油脂含量快速测定方法


李凡正,高新蕾,刘 晔

(武汉工业学院 化学与环境工程学院,武汉430023)


摘要:为了快速测定真菌油脂的含量,对油脂含量的测定方法进行了研究。建立了一种真菌油脂含量快速测定方法,这种方法是将湿菌体经微波预处理后,直接皂化, 生成甘油,然后再将甘油直接转化为三乙酸甘油酯,用气相色谱法分析生成的三乙酸甘油酯以检测菌体中油脂的含量。试验结果表明,所建立的真菌油脂含量快速测定方法的精密度及可靠性良好,该方法的回收率范围为97.99%~104.96%,变异系数不超过3.76%。该方法中,微波预处理的功率为420 W,时间为2 min;微波强化皂化的功率为140 W,时间为4 min;甘油酯化时间为10 min。

关键词:真菌油脂;微波处理;三乙酸甘油酯;菌丝体含油量

中图分类号:TS222;Q936   文献标志码:A   文章编号:1003-7969(2010)09-0070-04


Rapid detection of oil content in fungi

LI Fanzheng,GAO Xinlei,LIU Ye

(School of Chemical and Environmental Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)


Abstract:Rapid detection method of the oil content in fungi was studied. The wet mycelium pretreated by microwave with the power of 420 W and the time of 2 min was treated directly with KOH-CH3OH under the microwave treating conditions of the power of 140 W and the time of 4 min to saponify the oil, and the glycerol obtained from the saponification was esterified for 10 min to obtain glycerol triacetate,then GC was employed to identify the glycerol triacetate so as to determine the oil content in mycelium. The results showed that the coefficient of recovery of the rapid detection method was 97.99%-104.96%, and the coefficient of variation was less than 3.76%. The method of rapid detection possessed the characters of a good precision, accuracy and reliability. 

Key words:fungal oil; microwave treatment; glycerol triacetate; oil content in mycelium

    微生物油脂是目前受到广泛关注的动植物油脂补充或替代油源,而且能够提供多种特种脂质,因此发展潜力巨大[1-2]。无论在菌种资源的筛选,还是在培养基成分和培养条件的优化方面,均需要方便可靠的微生物油脂测定方法。由于真菌是目前公认产油能力较强、培养收集较为便利的微生物品种,因此建立真菌油脂含量的测定方法具有重要意义。

    目前用于微生物油脂含量测定的方法主要有:①脂肪染色法,其操作较为简单,但结果判断较困难,且重复性差,对油脂含量差别较小的菌株则不易辨别[3];②索氏抽提法,其提取效果较好,但样品需要量大,操作复杂且耗时长;③萃取-气相色谱法,涉及油脂的有机溶剂萃取、酯化处理及气相色谱分析[4],其中溶剂萃取的效果对测定结果影响显著;④近红外(NIRS)定量法[5],该法操作简单、分析速度快,但是建立在其他测定方法基础之上的,是一种“再生”的测定方法[6,7]。针对以上方法的不足,我们提出利用微波处理破坏细胞壁结构以提高胞内油脂的提取效率,利用皂化-酯化过程将与甘油三酯结合的甘油转化为可快速检测的三乙酸甘油酯,进而获得微生物油脂含量的可靠数据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

    深黄被孢霉(Mortierella isabellina CGMCC 33410)和短刺小颗银汉霉(Cunninghamella blakeleana CGMCC 3.970)购自中国微生物保藏中心;产油霉菌(编号3.2),为自筛菌株;各菌种均保藏于PDA斜面培养基上。二十烷,含量不小于95%,购自天津市化学试剂研究所。其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器、设备

    HH CD-7培养箱,HZQ-2振荡摇床,5BGH发酵罐,G8023SCL-2C微波炉,GC9800气相色谱仪,日立S-3000N扫描电镜。

1.3 试验方法

1.3.1 真菌培养及菌丝体收集 将菌种接于新制的PDA[8]斜面培养基上,于29 ℃的培养箱中培养5 d。用10 mL PDA培养基洗下斜面上的孢子制得孢子悬液,接种于100 mL PDA培养基中,置于29 ℃摇床中以140 r/min转速培养48 h。抽滤收集PDA液体培养基菌体,转移至4 L限氮培养基[9]中,在发酵罐中以通气量0.1 m3/h和搅拌转速300 r/min培养120 h,抽滤收集菌体。

1.3.2 菌丝体含水量测定 精确称取0.5 g湿菌,在105 ℃烘箱中干燥至恒重,计算含水量H。

1.3.3 菌丝体含油量测定 ①微波处理:于7 mL离心管中称取0.2 g左右的湿菌,置于微波炉中420 W处理2 min,冷却待皂化。②皂化处理:加入2 mL 5%的KOH-甲醇溶液,充分振荡混匀后,分别于68 ℃水浴、68 ℃超声波水浴(300 W,45 kHz)和微波炉(140 W)中封管进行皂化反应。③甘油酯化处理:把皂化液用甲醇定容到5 mL,取其中0.2 mL转入5 mL容量瓶中,加入3 mL酯化反应液(乙酸、BF3-乙醚、乙酸酐体积比为3∶ 1∶ 2)并混匀,室温下反应10 min,待冷却后加入1 mL质量浓度为9.752 mg/mL的二十烷乙醚溶液,再用乙醚定容到5 mL。④气相色谱分析:上述酯化样品采用气相色谱仪分析。色谱柱为0.1 μm×0.25 mm×30 m PEG-20M玻璃毛细管色谱柱。柱温180 ℃,汽化室温度200 ℃,氢火焰检测器温度240 ℃。载气为高纯氮气,分流比30∶ 1。进样量为0.5 μL。图谱用HL-3000色谱工作站分析。采用内标法以峰面积比确定甘油质量浓度CG。⑤菌丝体含油量X按下式计算:

      X=CG×25×884/[92×m×(1-H)]×100%

式中:m——菌丝样品质量,mg;

H——菌丝体含水量,%;

     884和92分别为油脂平均相对分子质量(根   据脂肪酸组成计算)和甘油相对分子质量。

1.3.4 回收率试验 用7 mL离心管精确称取湿菌丝体,记录质量m(mg),微波(420 W)处理2 min,冷却后混入质量为m1(mg)的大豆油,按1.3.3方法测定混合样品含油量X1。样品回收率按下式计算:

    回收率=[m×(1-H)+m1]×X1/[m×X×(1-H)+ m1]×100%

1.3.5 扫描电镜分析 微波处理菌体及对照菌体分别用生理盐水洗涤3次,取1 mL菌悬液,加入2 mL 2%的戊二醛并混匀,室温下静置固定30 min。在净化处理后的载玻片上滴加1%的聚赖氨酸溶液并于4 ℃下干燥待用。将菌悬液滴在载玻片上,室温下静置10 min,用0.1 mol/L pH为7的磷酸盐缓冲液清洗,最后用50%、70%、90%、100%的乙醇梯度脱水,最后置于超净工作台内风干。将上述样品以导电胶固定于样品台上,真空镀膜后以扫描电镜观察。

2 结果与讨论

2.1 微波处理效果

    对微波处理前后的3.3410发酵菌丝体,分别进行放大2 000倍和5 000倍的扫描电镜分析,结果如图1所示。

    图1 微波处理前后菌丝体的电镜扫描图

    由图1 (A)、(B)可以看出,微波处理前的深黄被孢霉3.3410呈杆状,菌丝饱满,表面平滑;由(C)、(D)可以看出,微波处理后,菌丝收缩,表面出现孔洞或裂纹,表明细胞结构遭到破坏。微波辐射过程是高频电磁波穿透细胞壁,直接作用于细胞内的水分,导致细胞内部温度迅速上升,液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破,形成微小的孔洞。而进一步加热,可导致细胞内部水分减少,细胞收缩,表面出现裂纹。孔洞或裂纹的存在可以使溶剂容易进入细胞内,溶解并释放出胞内物质[10]。与传统的破胞方法(球磨法、匀浆法、超声波法、冻融法、渗透压法、酸或碱热法、渗透剂法、酶法)相比,微波破胞法快速省时、破胞效果好,操作方便[11,12]。经预试验发现,0.2 g湿菌体在微波420 W处理2 min即可获得良好的破胞效果。

2.2 皂化处理

    微生物油脂的主要成分为甘油三酯和少量磷脂,传统的有机溶剂萃取效率较低,因此检测误差大。为此,在微波破胞的基础上,利用皂化反应释放甘油三酯中的结合甘油,从而将复杂的油脂检测转化为较为容易的甘油检测。为了提高皂化效率,对比考察了68 ℃恒温皂化、68 ℃超声波皂化和140 W微波强化皂化对甘油检出含量(以干菌体的质量为基准)的影响,结果如图2、图3所示。

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图2 68 ℃恒温、超声波皂化对甘油检出含量的影响

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图3 微波强化皂化对甘油检出含量的影响

    由图2可知,68 ℃恒温皂化和68 ℃超声波皂化的完成时间分别为2.0 h和1.5 h,表明超声波可有效提高反应效率;而从图3可以看出,微波强化反应效果十分显著,仅需4 min即可完成皂化。由于微波能具有激活化学物质、 快速加热、 加速或选择性进行化学反应等特性,且不破坏被测物质,因此利用微波技术快速测定各种样品的理化项目的报道很多[13,14],但大部分是利用微波的快速热效率来提高分析检测速度。而在本研究中,采用特制的高压反应管实施微波强化反应,也显示了良好的效果。此外,超声波皂化过程仅需采用较为简单的密封管,对仪器要求较低,在许多场合也是可选的途径。

2.3 甘油的酯化及气相色谱定量

    皂化液中含有甘油以及脂肪酸皂,因此提供了两种油脂含量的定量途径:其一是采用常规方法完成脂肪酸甲酯化,利用气相色谱定量,然后计算油脂含量[15];其二是检测甘油,进而计算油脂含量。通过预试验发现,皂化液中的甘油可与酯化反应液在常温下迅速反应,仅需10 min即可完全转化为三乙酸甘油酯,为气相色谱分析创造了良好的条件。图4、图5分别列出了上述两种分析途径的气相色谱图。

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图4 脂肪酸甲酯气相色谱图

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图5 三乙酸甘油酯气相色谱图

    由图4可知,脂肪酸甲酯的气相色谱分析需要约15 min完成;而图5表明,三乙酸甘油酯的分析可在7 min内完成,分析时间短。此外,微生物油脂中往往含有大量高不饱和脂肪酸,在处理过程中容易发生氧化而导致分析结果产生较大偏差。而甘油则比较稳定,检测结果较为可靠。再有,脂肪酸甲酯化过程较长且涉及萃取和脱水过程,因此产生误差的几率较高。据此可知,无论从衍生化的效率及效果,还是从气相色谱分析的速度看,通过测定甘油含量确定油脂含量都具有一定优势。

2.4 方法的精密度和回收率

    收集限氮培养基和PDA培养基中的3种菌株菌丝体作为测定样本,分别做3次平行测定,测定结果的标准差和变异系数如表1所示。

表1 测定精密度分析

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    由表1可知,当样本含油量在12.18%~5406%之间时,测定值变异系数小于3.76%,表明方法具有良好的精密度。而且,培养基种类和菌株种类并未对精密度产生显著影响,说明方法具有良好的通用性。

    表2显示了回收率试验结果。对于不同的菌种样本,回收率在97.99%~104.96%之间,表明方法具有较好的可靠性。

表2 回收率试验结果

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2.5 菌体含油量测定方法比较

    以深黄被孢霉3.3410为样本,分别采用萃取-气相色谱法[15]、索氏抽提法[16]和本研究所建立的快速测定法测定含油量,结果列于表3。除此之外,还列出了各种方法所需的样品量和实际操作时间。

表3 不同测定方法测定3.3410样本干菌含油量比较

 

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    由表3可知,3种测定方法测定值总体较为接近,而采用气相色谱定量的两种方法(快速测定法和萃取-气相色谱法)所得结果较索氏抽提法略高。其原因在于,索氏抽提法往往不能彻底萃取菌体内的油脂(利用快速测定法测定索氏抽提法抽提残渣,含油量在0.2%~4%之间)。据此可知,快速测定法与传统方法相比,具有可靠性高,样品用量少,操作耗时短的优点,尤其适合于大量产油菌种的筛选以及发酵动力学研究。必须指出,若培养基中含甘油或菌种能合成甘油,快速测定法的结果将受到干扰。

3 结 论

    建立了基于微波破胞的真菌油脂含量快速测定方法。利用微波直接处理湿菌体,可获得良好的破胞效果。利用微波强化皂化,结合甘油的快速酯化,可将微生物油脂中的结合甘油转化为易于利用气相色谱定量的三乙酸甘油酯,进而计算菌体中的油脂含量。该方法的变异系数不超过3.76%, 回收率在97.99%~104.96%之间,具有良好的精密度和可靠性。此外,该方法还具有样品用量少,操作耗时短等优点,适合大批次样品的分析。

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