Neutrase和N120P蛋白酶同步水解杏仁 蛋白制备杏仁短肽工艺研究

Neutrase和N120P蛋白酶同步水解杏仁

蛋白制备杏仁短肽工艺研究

王春艳，田金强，王 强

(中国农业科学院 农产品加工研究所，北京100193)

摘要：采用Neutrase和N120P蛋白酶同步水解杏仁蛋白制备杏仁短肽, 以短肽得率（TCA-NSI）及水解度（DH）为指标对制备工艺进行优化，并建立了回归模型。结合实际生产确定出了Neutrase和N120P蛋白酶水解杏仁蛋白的最适条件为：底物质量浓度0.04 g/mL，pH 6.0，水解温度52.5 ℃，Neutrase与N120P复合酶比例2∶ 1，复合酶用量7 200 U/g，水解时间173.5 min。在此条件下，短肽得率为71.49%，水解度为26.20%。

关键词：杏仁蛋白；Neutrase蛋白酶；N120P蛋白酶；杏仁短肽

中图分类号：TS229；TQ936.1   文献标志码：A   文章编号：1003－7969(2010)10－0025－05

Preparation of almond oligopeptides by Neutrase and N120P enzymatic

hydrolysis from apricot kernel protein

WANG Chunyan, TIAN Jinqiang ,WANG Qiang

(Institute of Processing for Agriculture Products,Chinese Academy of 

Agricultural Sciences, Beijing 100193,China)

Abstract：Apricot (Prunus armeniaca L.) kernel protein was hydrolyzed by Neutrase and N120P proteases simultaneously to prepare almond oligopeptides.The yield of oligopeptides and the degree of hydrolysis were used as indexes,and the hydrolysis conditions were optimized and the regression models were established.The results indicated that the optimal conditions were as follows: pH 6.0, temperature 52.5 ℃,mass concentration of substrate 0.04 g/mL, enzyme activity ratio of Neutrase to N120P 2∶ 1，proteases dosage (based on protein mass) 7 200 U/g, time 173.5 min. Under the conditions,the yield of almond oligopeptides was 71.49%, and the degree of hydrolysis was 26.20%.

Key words：apricot kernel protein；Neutrase protease; N120P protease；almond oligopeptides

    杏仁是蔷薇科落叶乔木植物杏（Prunus armeniaca L.）的种仁,我国杏仁产量居世界前列。杏仁中蛋白质含量达25%，其氨基酸组成平衡合理，营养价值较高［1］。杏仁广泛用于食品加工的配料以及冷榨杏仁油的提取。榨油后的杏仁饼中蛋白质含量高达40%以上，可作为良好的蛋白质来源。但目前仅有少量用于制备杏仁蛋白粉或加工饲料，且制备的杏仁蛋白粉溶解性和功能性质较差，而大部分杏仁饼被浪费。因此，深入研究和开发杏仁蛋白资源，生产高附加值产品成为杏仁蛋白加工中亟待解决的问题。

    酶法水解制备功能性短肽具有反应条件温和、产物营养价值较高等特点。在目前报道的短肽制备工艺中，多选用Alcalase碱性蛋白酶作为工具酶［2-4］，虽然水解效果较好，但存在产品精制工艺繁琐，脱盐困难等难题，而采用两种中性蛋白酶进行复合酶水解不仅可获得较高的水解度和短肽得率，还可避免精制中的脱盐问题。Neutrase蛋白酶来源于枯草芽孢杆菌，具有广泛的酶切作用位点；N120P酶是由选育出的芽孢杆菌生产而得，主要作用于丙氨酸、缬氨酸以及芳香族氨基酸等参与组成的肽键。而甜杏仁饼中丙氨酸、缬氨酸以及苯丙氨酸等氨基酸含量占氨基酸总量20%以上［5，6］，因此Neutrase和N120P是研究水解杏仁蛋白的理想蛋白酶。

    本文以冷榨杏仁饼为原料，用Neutrase和N120P两种中性蛋白酶对其进行复合水解，研究水解过程中水解度和短肽得率的变化，确定酶解制备杏仁短肽的最佳工艺条件，以期为深入开发利用杏仁蛋白资源及杏仁蛋白深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂

    杏仁蛋白粉：冷榨杏仁饼粉碎，过100目筛制得（新疆奥力克生态农业公司）；Neutrase蛋白酶（酶活力1.611×105 U/g，Novo公司）；N120P（酶活力2192×105 U/g，Kerry公司）；Folin-酚试剂（Sigma公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器、设备

    Kieletec analysiser全自动凯氏定氮仪（瑞典Foss公司），Soxtec Avanti 2050自动索氏总脂肪分析系统（瑞典Foss公司），CS501-SP超级数显恒温器，UV-1201紫外分光光度计。

1.3 分析方法

1.3.1 杏仁饼中各组分的测定 水分测定： GB/T 5009.3—2003；灰分测定：GB/T 5009.4—2003；蛋白质测定：GB/T 5009.5—2003；脂肪测定：GB/T 5009.6—2003；粗纤维测定：GB/T 5009.10—2003；总糖测定：苯酚硫酸法［7］。

1.3.2 蛋白酶活力的测定 Folin-酚法［8］。

1.3.3 可溶性氮的测定 Folin-酚法。

1.3.4 短肽得率测定 三氯乙酸（TCA）可溶性氮法［9］。

     短肽得率=N1/N0×100%

式中：N1——在10%TCA中可溶性氮含量，mg；

N0——原料中总氮含量，mg。

1.3.5 水解度（DH）的测定 OPA法［10,11］。

1.4 杏仁短肽的制备

1.4.1 单因素试验 基于Novo公司和Kerry公司推荐的Neutrase和N120P酶适宜作用条件，确定复合酶水解的单因素试验条件。酶水解基本条件定为：底物质量浓度0.04 g/mL,Neutrase和N120P复合酶比例2∶ 1，酶总用量3 000 U/g（以蛋白质量为基准），pH 6.0，水解温度55 ℃，水解时间180 min。反应结束后90 ℃水浴15 min灭酶，定容至250 mL，测定短肽得率和水解度。改变其中1个条件，固定其他条件分别考察复合酶比例、复合酶用量、水解pH、底物质量浓度、水解温度和水解时间对短肽得率和水解度的影响。

1.4.2 正交旋转组合试验 根据单因素试验结果，选择适当的试验因素及水平，进行正交旋转组合试验，以优化确定最佳水解条件。

2 结果与分析

2.1 杏仁饼组成（见表1）

表1 杏仁饼的组成 %

2.2 复合酶水解制备杏仁短肽单因素试验

2.2.1 Neutrase和N120P复合酶比例的确定 Neutrase和N120P酶按2∶ 5、1∶ 2、2∶ 3、1∶ 1、3∶ 2、2∶ 1、5∶ 2（酶活比）比例添加，其他条件同1.4.1，考察复合酶比例对短肽得率和水解度的影响，结果见图1。

图1 酶比例对短肽得率和水解度的影响

    由图1可看出，短肽得率和水解度随Neutrase比例的增大呈先增加后降低趋势，当Neutrase与N120P酶活比为2∶ 1时均达到最大，因此确定适宜的复合酶比例为2∶ 1。

2.2.2 复合酶用量的确定 试验以酶用量550 U/g为基础进一步提高复合酶的用量，来研究酶用量对短肽得率和水解度的影响，结果见图2。

图2 复合酶用量对短肽得率和水解度的影响

    由图2可见，在水解初期，大分子蛋白迅速减少，小分子肽迅速增加；当酶用量达到5 400 U/g时，短肽得率和水解度分别达到（56.84±1.59）%和（15.14±033）%；继续增加酶用量短肽得率和水解度增幅变缓。这是因为此时底物饱和，蛋白酶的作用位点已经大大减少，再进一步增加酶用量对提高短肽得率的效果已不显著，尽管此时蛋白酶仍会产生作用，但体系中的水解度上升非常缓慢。

2.2.3 水解pH的确定 pH对酶促水解反应的影响可通过改变酶的空间构象和底物的解离状态，进而影响底物与酶的结合［12］。一般来说，一种酶仅在一个狭窄的pH范围内才具有最高的活力，即酶的最适pH。试验分析了pH在5.0～8.5范围内体系短肽得率和水解度的变化，结果见图3。

图3 pH对短肽得率和水解度的影响

    由图3可见，随着pH的升高，短肽得率和水解度均呈先增大后降低趋势，并在pH为6.0时，二者达到最大值，分别为（64.88±1.59）%和（17.15±0.88）%。当体系pH超过6.5时，短肽得率和水解度相比于pH 6.0时呈现迅速下降趋势。因此,选择pH 6.0～6.5作为复合酶水解的最适pH。

2.2.4 底物质量浓度的确定 试验分析了底物质量浓度在0.005~0.10 g/mL范围内，短肽得率和水解度的变化，结果见图4。

图4 底物质量浓度对短肽得率和水解度的影响

    由图4可知，底物质量浓度在0.01~0.10 g/mL范围内，体系存在底物抑制现象，即随着底物质量浓度的增加短肽得率和水解度均有所下降。过高底物质量浓度易造成水解液黏度增大，影响蛋白酶扩散，降低水分活度，对水解反应有抑制作用。底物质量浓度在0.005~0.01 g/mL范围内短肽得率和水解度差异不显著，当底物质量浓度为0.01 g/mL时短肽得率和水解度最大。但在实际生产中底物质量浓度过低造成生产效率低，因而不宜选择过低的底物质量浓度。

2.2.5 水解温度的确定 试验分析了40～65 ℃范围内短肽得率和水解度的变化，结果见图5。

图5 水解温度对短肽得率和水解度的影响

    由图5可见，复合酶的作用温度范围较宽，在40～55 ℃都具有较强的活性。短肽得率和水解度随水解温度升高均呈先增加后降低趋势，50 ℃时水解度达最大值（17.16±0.33）%，55 ℃时短肽得率达到最大值（55.15±1.03）%，超过55 ℃后体系短肽得率和水解度则迅速下降。酶催化反应都有其最适温度，一般在酶的最适温度以下，随着温度的升高反应物的能量和分子间有效接触的频率增加，因而反应速度加快。当温度上升到一定程度时，酶分子吸收了过多的能量，引起了维持酶分子结构的次级键解体，导致酶变性，从而使得酶活性减弱或丧失。

2.2.6 水解时间的确定 不同水解时间对短肽得率和水解度的影响见图6。

图6 水解时间对短肽得率和水解度的影响

    由图6可见，随着水解时间的延长，短肽得率和水解度总体呈上升趋势。在水解150 min时，短肽得率和水解度分别达到（73.88±0.68）%和（19.94±0.38）%，而后继续水解，短肽得率和水解度虽然仍有所上升，但到270 min时上升幅度仅为2.01%和0.81%。这可能是因为在水解过程中，酶切位点逐渐减少，反应达到一定程度时，即使继续水解，能够与蛋白酶发生作用的底物也越来越有限。

2.3 正交旋转组合试验

    根据单因素试验结果，确定水解pH 为6.0，Neutrase和N120P复合酶比例为2∶ 1，着重研究复合酶用量、水解温度、底物质量浓度、水解时间4个因素。以短肽得率和水解度为指标，选用四元二次正交旋转组合设计进行研究，以确定最佳水解条件。试验因素水平编码见表2，试验设计及结果见表3。

表2 因素水平

表3 正交旋转试验结果

2.3.1 模型的数学分析 采用DPS数据处理系统用标准多项式回归方法对试验数据进行拟合，剔除α=0.05显著水平不显著项后,得到短肽得率的回归方程为：Y=59.178 42-1.352 45X1+12.238 55X2-6.244 58X3+ 2357 21X4-3.171 52X21-1.500 98X22-1.099 7X24；水解度的回归方程为：Y=26.983 78-1.195 59X1+1726 66X2-3.601 57X3+1.129 93X4-1.991 44X22-0.679 75X23-0.511 82X24-0.653 75X1X2-0881 25X1X3+0.768 75X1X4。

    对表3试验结果进行方差分析，结果见表4。

    表4中短肽得率和水解度的回归方程显著性检验的F值分别为69.655 1及39.172 1，且p＜0.01，表明回归方程达到极显著水平，反映出该方程式在试验点上与试验结果相吻合。失拟性检验F值分别为2.224 05及0.983 168，说明回归方程无失拟因素存在（p＞0.05）。水解温度、复合酶用量、底物质量浓度和水解时间的影响均较大（p＜0.05），以短肽得率为指标时各因素的交互作用不显著（p＞005），而以水解度为指标时X1X2、X1X3、X1X4间存在显著的交互作用（p＞005）。

    综合考虑各指标，通过求方程偏导得出4个因素对于指标的最优水平分别为：X1=0.000 0，X2=1.681 8，X3=-1.681 8，X4=1.000 0，即复合酶水解制备杏仁短肽最佳工艺条件：水解温度52.5 ℃，复合酶用量7 200 U/g，底物质量浓度0.02 g/mL，水解时间173.5 min。

表4 试验结果方差分析

2.3.2 最优工艺参数的选取 由回归模型可知，反应最适底物质量浓度为002 g/mL，底物质量浓度值较低。由于生产时提高底物质量浓度可以减少能耗、提高设备利用率，因而实际生产中可根据模型选用较高底物质量浓度。因此，在模型得出的最佳工艺基础上，提高底物质量浓度以得出较适宜的操作条件，结果见表5。由表5可见，选取0.04 g/mL作为适宜的底物质量浓度，其他因素均为最优条件，短肽得率为（71.49±1.48）%，水解度为（2620±035）%。

表5 不同底物质量浓度下的短肽得率和水解度

 注：a、b、c、d、e表示显著性差异，p<0.05。

3 结 论

  采用Neutrase和N120P中性蛋白酶作为工具酶水解杏仁蛋白制备杏仁短肽，通过单因素试验和正交旋转组合试验建立了水解度和短肽得率与各影响因素间的回归模型。结合实际生产，确定Neutrase与N120P复合酶水解杏仁蛋白的最佳条件为：水解温度52.5 ℃，Neutrase与N120P复合酶比例2∶ 1，复合酶用量7 200 U/g，底物质量浓度0.04 g/mL，水解时间173.5 min。在此条件下短肽得率为71.49%，水解度为26.20%。

参考文献：

［1］ 张君萍．新疆若干杏品种果实主要营养成分的测定与分析评价［D］．乌鲁木齐：新疆农业大学，2006.

［2］ 张宇昊，王强．花生蛋白的开发与利用［J］．花生学报，2005，34（4）：12-16．

［3］ ZHENG Hai, SHEN Xiaoqin, BU Guanhao, et al.Effects of pH, temperature and enzyme-to-substrate ratio on the antigenicity of whey protein hydrolysates prepared by Alcalase［J］. International Dairy Journal, 2008,18: 1028-1033.

［4］ CHIANG W D, TSOU M J , TSAI Z Y , et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor［J］. Food Chemistry,2006 ,98 :725-732.

［5］ 王淑英，温哲屹，李慧颖．我国甜杏仁营养成分含量分析［J］．北京农业，2008（9）：13-15． 

［6］ 盛小娜，王璋，许时婴．甜杏仁蛋白的功能和结构的研究［J］．食品工业科技, 2008，29（5）：133-136．

［7］ DUBIS M. Colorimetric method for determination of sugar and related substances［J］. Anal Chem, 1956,28:349-352. 

［8］ OWUEU-APENTEN R K. Food Protein Analysis［M］. New York: Marcel Dekker, Inc,2002.

［9］ JANG A, LEE M. Purification and identification of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from beef hydrolysates［J］. Meat Sci, 2005,69:653-661.

［10］ FRISTER H, MEISE H, SCHLIMME E. OPA method modified by use of N,N-dimethyl-2-mercaptoethylammonium chloride as thiol component［J］. Fresenius’Journal of Analytical Chemistry,1988,330(7):1432-1130.

［11］ PETERSEN D, NIELSEN P M, CAMBMANN C.Determination of the degree of hydrolysis (DH) based on OPA reaction: ED-9512723［S］.Novo Nordisk A/S, Denmark Dec. 1995.

［12］ 薛朝辉．菜籽肽的制备及其生物活性的研究［D］.武汉：华中农业大学，2004.