制备芝麻抗氧化肽的蛋白酶筛选

制备芝麻抗氧化肽的蛋白酶筛选

芦鑫1,2，姜梦楠3，张丽霞1,2，孙强1,2，宋国辉1,2，黄纪念1,2

     (1.河南省农业科学院农副产品加工研究所，郑州 450002； 2.河南省农产品生物活性物质

     工程技术研究中心，郑州 450002； 3.河南农业大学 食品科学技术学院，郑州 450002)

摘要：研究了菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶2709和Alcalase蛋白酶分别酶解芝麻蛋白制备芝麻抗氧化肽，测定多肽产率、水解度并评价抗氧化活性，以多肽产率和抗氧化活性为参数采用逼近理想解排序法对酶解物进行排序，确定适宜制备芝麻抗氧化肽的蛋白酶。结果表明：蛋白酶品种差异会显著影响芝麻抗氧化肽的制备效果；在加酶量相同时，碱性蛋白酶2709、Alcalase蛋白酶、胰蛋白酶酶解芝麻蛋白能力强，多肽产率高，且抗氧化活性强；根据与最优向量距离总和，用于制备芝麻抗氧化肽蛋白酶的适宜性由高到低依次为碱性蛋白酶2709、Alcalase蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。

关键词：芝麻蛋白；抗氧化肽；蛋白酶；逼近理想解排序法

中图分类号：TS229;TS218 文献标识码：A  文章编号：1003-7969（2018）11-0028-06  

Screening of protease for preparing antioxidant peptide from sesame protein

     LU Xin1,2, JIANG Mengnan3, ZHANG Lixia1,2, SUN Qiang1,2,

     SONG Guohui1,2, HUANG Jinian1,2

     (1.Institute of Agricultural and Sideline Products Processing of Henan Academy of Agricultural Sciences, 

     Zhengzhou 450002, China; 2.Henan Engineering Research Centre of Bioactive Substances in Agricultural 

     Products, Zhengzhou 450002, China; 3. College of Food Science and Technology, Henan 

     Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

     Abstract：To select the suitable protease hydrolyzing sesame protein to generate antioxidant peptide, the yields of peptide, degrees of hydrolysis and antioxidant capacities were determined during hydrolyzing sesame protein by Bromelain, Papain, Neutrase, Trypsin, alkaline protease 2709 and Alcalase, then the yield of peptide and antioxidant capacities were analyzed by technique for order preference by similarity to ideal solution to ascertain the order of hydrolysate derived from six proteases. The results showed that varieties difference of protease significantly influenced the performance of antioxidant peptide prepared from sesame protein. When the enzyme addition was the same, high degree of hydrolysis and yield of peptide were observed in hydrolyzing sesame protein by alkaline protease 2709, Alcalase and Trypsin, and their hydrolysates showed high antioxidant activity. According to the sum of distance of optimal vector, the suitable protease for preparation of antioxidant peptide from sesame protein from high to low was obtained as follows: alkaline protease 2709, Alcalase, Trypsin, Neutrase, Bromelain and Papain.

     Key words：sesame protein; antioxidant peptide; protease; technique for order preference by similarity to ideal solution

     芝麻是我国主要的油料作物之一，油脂含量约为50%，蛋白质含量为20%~22%[1]。芝麻在我国主要用于榨油，每年产生50万t以上芝麻饼粕[2]。研究表明，芝麻饼粕中富含蛋白质，含量为38%~50%，具有开发利用价值[3]。由于缺乏加工技术，目前芝麻饼粕主要用作饲料与肥料。利用蛋白酶酶解蛋白可生产具有降血压、抗氧化、抗菌、调节免疫等生理功能的活性肽[3]。芝麻蛋白经过酶解可以制备抗氧化肽与降血压肽[4-6]。由于不同的蛋白酶作用肽键位点的不同, 通过酶解得到不同特性的肽类, 同时试验条件的差异也会对酶解产物产生重要的影响。因此, 选择合适的酶是保证制备高活性抗氧化肽的关键[7]。目前，关于制备芝麻抗氧化肽适用的蛋白酶种类报道较少，有必要对适用制备芝麻抗氧化肽的蛋白酶进行筛选。抗氧化能力的评价方法尚未统一，其根据原理，可以划分成清除自由基方法，如1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力法、2，2′-联氮双( 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）自由基清除能力法；还原氧化物能力法，如还原铁离子能力法（FRAP）；细胞抗氧化评价等[8]。同种物质采用不同抗氧化测定方法，其结果存在差异，这影响对该物质的抗氧化能力的评价。因此，需要综合考虑多种抗氧化测定的结果。逼近理想解排序法（TOPSIS）是系统工程中常用的多指标综合评价方法，通过计算评价对象到最优向量与最劣向量的距离，进而对评价对象进行排序，优化方案应该距理想解近，而距负理想解远[9-10]。本研究通过测定木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶2709、Alcalase蛋白酶酶解芝麻蛋白制备抗氧化肽的产率、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、FRAP值，利用TOPSIS算法对上述指标进行综合排序，找出制备芝麻抗氧化肽的最佳工具酶，为后续芝麻抗氧化肽的研究提供参考。

     1材料与方法

     1.1试验材料低温芝麻粕：实验室自制，低温压榨后，采用沸程30~60 ℃石油醚50 ℃索氏抽提6 h，回收溶剂，获得低温芝麻粕。胰蛋白酶(酶活1.10×105 U/g)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；中性蛋白酶（酶活6.51×104 U/g )，广州裕立宝生物科技有限公司；菠萝蛋白酶(酶活5.84×104 U/g)、 碱性蛋白酶2709 (酶活2.42×105 U/g)，上海源叶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶(酶活5.95×104 U/g)，国药集团化学试剂有限公司；Alcalase蛋白酶（酶活2.81×105 U/g)、DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝，美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。TGL20M-Ⅱ高速冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；TGL-16A小型离心机， 上海悦峰仪器仪表有限公司；UV-6300双光束型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；DNM-9606酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司；XS205分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；DF-101S集热式磁力搅拌器，金坛市医疗器械厂。

     1.2试验方法

     1.2.1芝麻蛋白制备参考袁东振等[11]的方法。取低温芝麻粕以质量体积比1∶ 18加入蒸馏水，采用5 mol/L NaOH 调节溶液pH至10.5，45 ℃搅拌提取30 min，5 000 r/min 离心30 min，收集上清液，调节pH 5.0，5 000 r/min离心30 min，收集沉淀。采用相同条件对沉淀进行碱溶酸沉二次处理，将沉淀中和后，采用截留相对分子质量为5 000 Da透析膜透析，冻干，获得芝麻蛋白，纯度为（85.03±0.37）%。

     1.2.2芝麻抗氧化肽制备分别取58.80 g 芝麻蛋白加入1 000 mL水，结合文献报道与蛋白酶使用说明书，采用5 mol/L NaOH 调节溶液pH（木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶2709和Alcalase蛋白酶的pH分别为6.5、6.5、7.0、8.0、10、10），加入6 000 U/g的蛋白酶，45 ℃酶解5 h，每隔0.5 h取10 mL酶解液，沸水浴灭酶10 min，8 000 r/min离心10 min，收集上清液备用。

     1.2.3多肽产率测定取0.5 mL上清液加入到Amicon Ultra-0.5超滤离心管（截留相对分子质量1万Da滤芯）以8 000 r/min 离心30 min，取透过液与酶解液采用考马斯亮蓝法测定多肽与蛋白质浓度[12]。按下式计算多肽产率。多肽产率=MpMf×100%式中：Mp为透过液中多肽质量，mg；Mf为酶解液中蛋白质质量，mg。

     1.2.4水解度测定修改Adler-Nissen[13]方法，上清液适当稀释后，取0.125 mL稀释液于试管中，随后加入1 mL、pH 8.2磷酸缓冲液和1 mL、体积分数0.1%的TNBS，铝箔遮光，在水浴锅中50 ℃振荡60 min。最后用2 mL、0.1 mol/L的盐酸进行终止反应，室温静置30 min。以0~2 mmol/L的L-亮氨酸制作标准曲线，在波长340 nm处测定吸光度[14]。按下式计算蛋白水解度。水解度=hhtot×100%式中：h为1 g酶解物被裂解所含的肽键量，mmol/g；htot为每克原料蛋白质总的肽键量，mmol/g，芝麻蛋白的htot取8 mmol/g。

     1.2.5DPPH自由基清除能力测定取0.5 mL上清液加入Amicon Ultra-0.5超滤离心管（截留相对分子质量1万Da滤芯）以8 000 r/min离心30 mim，将透过液中多肽质量浓度稀释至3 mg/mL，取稀释液100 μL加入到96孔酶标板中，随后加入100 μL 2×10-4 mol/L DPPH乙醇溶液，振荡30 s，室温避光反应30 min，在波长517 nm处测定吸光度Ai，以同样的方法同时测定100 μL样品与100 μL乙醇混合后的吸光度Aj，100 μL DPPH溶液与100 μL乙醇混合后的吸光度A0[15]。按下式计算DPPH自由基清除率（DI）。 DI=(1-Ai-AjA0)×100%

     1.2.6ABTS自由基清除能力测定取5 mL、7.4 mmol/L ABTS溶液和5 mL、2.6 mmol/L过硫酸钾混合，室温避光放置16 h制备ABTS溶液，测定时在波长734 nm处用甲醇将ABTS溶液稀释至其吸光度为（0.70±0.02）。取25 μL 3 mg/mL多肽溶液加入到96孔酶标板中，随后加入200 μL ABTS溶液，室温避光静置6 min，在波长734 nm处测定吸光度Ai′，测定25 μL 3 mg/mL多肽溶液与200 μL甲醇混合物的吸光度Aj′，25 μL甲醇与2 mL ABTS溶液混合物的吸光度A0′[16]。按下式计算ABTS自由基清除率(AI)。AI=(1-Ai′-Aj′A0′)×100%

     1.2.7FRAP测定取50 μL 3 mg/mL多肽溶液加入到96孔酶标板中，随后加入150 μL FRAP工作液（由pH 3.6、03 mol/L醋酸盐缓冲液，10 mmol/L TPTZ，20 mmol/L FeCl3溶液以10∶ 1∶ 1比例混合），振荡30 s，避光37 ℃反应30 min，在波长593 nm处测定吸光度。另以0~2 mmol/L FeSO4标准溶液代替样品作标准曲线。样品的总抗氧化能力以具有相同吸光度的FeSO4的浓度表示，单位为mmol/L[17]。

     1.2.8数据处理采用SAS 9.3进行单因素方差分析和TOPSIS算法排序（多肽产率、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和FRAP值权重均为1）。表中同一列中带有相同小写字母的样品间在0.05水平上无显著差异。

     2结果与分析

     2.1不同蛋白酶酶解芝麻蛋白制备抗氧化肽能力（见图1）

图1不同蛋白酶酶解芝麻蛋白的多肽产率与水解度

由图1可知，不同蛋白酶酶解芝麻蛋白呈现不同的效果。菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解芝麻蛋白能力较差，水解度低，多肽产率偏低，而胰蛋白酶、碱性蛋白酶2709、Alcalase蛋白酶水解芝麻蛋白能力强，水解度高，多肽产率高，酶解5 h后，水解度在25.99%~30.14%之间，多肽产率在24.42%~29.70%之间。这与蛋白酶作用位点及芝麻蛋白的自身组成有关，菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶水解位点较专一，菠萝蛋白酶水解位点在碱性氨基酸(如精氨酸)或芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸)的羧基侧上的肽链；木瓜蛋白酶水解位点在精氨酸和赖氨酸的羧基端、N-端酸性氨基酸或芳香族氨基酸；而碱性蛋白酶2709、Alcalase蛋白酶、胰蛋白酶作用范围广[7]。此外，芝麻蛋白是碱溶性蛋白，其等电点在4.3~4.5之间，当溶液pH从4.5继续增加时，芝麻蛋白自身负电荷增多，在静电排斥作用下，蛋白质分子伸展，分子内部间隙增加[18]。这些因素导致碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解效果好。

     2.2芝麻多肽抗氧化能力分析

     2.2.1芝麻多肽的DPPH自由基清除能力（见表1）

表1不同蛋白酶酶解芝麻蛋白制备的芝麻多肽的DPPH自由基清除率

注：酶解时间0 h蛋白溶液的DPPH自由基清除率为（0.02±0.01）%。

     由表1可知，6种蛋白酶酶解芝麻蛋白制备的芝麻多肽均有DPPH自由基清除能力，这表明芝麻多肽具有抗氧化活性，其中由胰蛋白酶酶解制备的芝麻多肽的DPPH清除能力最强，其次是碱性蛋白酶2709、Alcalase蛋白酶,其余3种蛋白酶制备的芝麻多肽DPPH自由基清除能力较弱。观察酶解时间与DPPH自由基清除率的关系发现：随着酶解时间从0 h 延长到2 h，DPPH自由基清除率呈现显著上升趋势，但是继续延长酶解时间，DPPH自由基清除率增加幅度减少，且有上下波动。这可能是酶解液中高活性的抗氧化肽被蛋白酶水解产生新的多肽，导致活性降低或增加，从而表现为总体DPPH自由基清除率下降或上升[7]。

     2.2.2芝麻多肽的ABTS自由基清除能力（见表2）

表2不同蛋白酶酶解芝麻蛋白制备的芝麻多肽的ABTS自由基清除率

注：酶解时间0 h蛋白溶液的ABTS自由基清除率为（0.01±0.01）%。

由表2可知，6种蛋白酶酶解芝麻蛋白制备的芝麻多肽具有ABTS自由基清除能力，这也显示芝麻多肽具有抗氧化能力，总体来看，由Alcalase蛋白酶制备的芝麻多肽ABTS自由基清除率最高，其次是碱性蛋白酶2709和胰蛋白酶。在酶解3 h内，芝麻多肽的ABTS自由基清除能力有显著提高，随后继续延长酶解时间，ABTS自由基清除能力变化不明显。

     2.2.3芝麻多肽的FRAP值（见表3）由表3可知，芝麻多肽除具有清除自由基的能力，还具有一定的还原金属阳离子的能力。胰蛋白酶和碱性蛋白酶2709酶解制备的芝麻多肽具有最高的FRAP值，其次是Alcalase蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。与DPPH、ABTS自由基清除率类似，芝麻多肽的FRAP变化主要在酶解3 h以内，随后FRAP值基本保持稳定。

表3不同蛋白酶酶解芝麻蛋白制备的芝麻多肽的FRAP值

注：酶解时间0 h蛋白溶液的FRAP值为（0.01±0.01）mmol/L。

     2.3制备芝麻抗氧化肽的工具酶筛选综上所述，6种蛋白酶酶解芝麻蛋白制备的芝麻多肽具有抗氧化性。采用DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和FRAP值对芝麻多肽抗氧活性进行评价时，对于同一样品的3个指标一致性较差，即高DPPH自由基清除率的样品，其ABTS自由基清除率与FRAP值并非也高。综合考虑芝麻抗氧化肽的产率和活性，采用TOPSIS算法对6种蛋白酶制备的多肽样品进行排序，结果见表4。

表4不同蛋白酶酶解芝麻蛋白制备抗氧化肽表现的TOPSIS排序

注：样品标号中B、P、N、T、J、A分别代表菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶2709、Alcalase蛋白酶的酶解液，1~10分别代表酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h。    

由表4可知，由菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶2709和Alcalase蛋白酶酶解物的与最优向量距离总和分别为2.434 9、2.880 5、2.378、1.363、1.292 3、1.297 3，可知6种蛋白酶作为制备芝麻抗氧化肽工具酶的适宜性由高到低依次为碱性蛋白酶2709、Alcalase蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。

     3结论

采用常用的6种蛋白酶酶解芝麻蛋白制备芝麻抗氧化肽，通过测定多肽产率、水解度、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和FRAP值，利用TOPSIS对酶解液的多肽产率和抗氧化活性进行综合排序筛选出适宜制备芝麻抗氧化肽的工具酶。结果表明：6种蛋白酶酶解芝麻蛋白的能力存在明显差异，碱性蛋白酶2709、Alcalase蛋白酶、胰蛋白酶酶解芝麻蛋白能力强，酶解5 h后，水解度在2599%~30.14%之间，多肽产率在24.42%~2970%之间；6种蛋白酶制备的芝麻多肽虽均具有抗氧化活性，但抗氧化活性存在显著差异，碱性蛋白酶、Alcalase蛋白酶、胰蛋白酶制备的芝麻抗氧化肽活性较强。此外，芝麻抗氧化肽的ABTS自由基清除能力高于DPPH自由基清除能力，抗氧化活性主要形成于酶解3 h以内，随后基本保持稳定；根据与最优向量距离总和，碱性蛋白酶2709最适宜用于制备芝麻抗氧化肽，随后依次为Alcalase蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。受时间所限，本文未研究不同蛋白酶复配酶解芝麻蛋白制备抗氧化肽的效果，以及酶解条件对芝麻抗氧化肽生成的影响，上述内容将在后续工作中进行研究。

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