生物柴油副产物甘油发酵生产1，3-丙二醇的研究

生物柴油副产物甘油发酵生产1，3-丙二醇的研究

胡秋龙1，2，郑宗明3，刘灿明1，刘德华4，刘祥华1

（1.湖南农业大学 作物种质创新与资源利用国家重点实验室，长沙410128； 2.湖南省食品质量监督检测所，

长沙410000； 3.华北电力大学 可再生能源学院，北京 102206； 4.清华大学 化学工程系，北京 100084）

摘要：对利用不同生物柴油副产物粗甘油发酵生产1,3-丙二醇的试验条件进行了研究。批次发酵试验结果表明：精制甘油（纯度＞98%)、生物柴油副产物粗甘油A（纯度83%）和B（纯度78%）及C（纯度68%）生成1,3-丙二醇的转化率分别为52.38%、48.08%、45.22%、39.95%；精制甘油、粗甘油A和B及C的流加补料发酵合成1,3-丙二醇的转化率分别为51.45%、44.63%、41.27%、35.39% 。经济效益粗略评估分析表明，生物柴油副产物粗甘油A和B生产单位1,3-丙二醇较精制甘油成本低，生物柴油副产物粗甘油C却较精制甘油成本高。

关键词：1，3-丙二醇；生物柴油副产物粗甘油；发酵 

中图分类号：TQ645;TQ923   文献标志码：A   文章编号：1003－7969(2010)10－0052－05

Microbial production of 1,3-propanediol with crude 

glycerol from biodiesel production

HU Qiulong1，2， ZHENG Zongming3，LIU Canming1，LIU Dehua4，LIU Xianghua1

(1.State Key Lab for Germplasm Innovation and Utilization of Crop, Hunan Agricultural University, Changsha 

410128，China; 2.Food Quality Supervision and Inspection Institute,Changsha 410000,China; 3.School of 

Renewable Energy, North China Electric University, Beijing 102206,China; 4.Department of 

Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084,China）

Abstract：The 1,3-propanediol (1,3-PD) production by fermentation with the crude glycerol from biodiesel production was investigated. The batch fermentation revealed that the 1,3-PD quality conversion rate of the refined glycerol (purity＞98%), crude glycerol A (purity＞83%), B (purity＞78%), and C (purity＞68%) was 52.38%,48.08%,45.22% and 39.95%， respectively. The 1,3-PD quality conversion rate of the refined glycerol, crude glycerol A, B, and C in fed-batch fermentation was 51.45%, 44.63%, 41.27% and 35.39%, respectively. The cost analysis showed that the employment of crude glycerol A and B could reduce the cost compared with the refined glycerol . However, the use of crude glycerol C could increased the cost compared with the refined glycerol.

Key words：1,3-propanediol; crude glycerol from biodiesel production; fermentation

  1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料，它最主要的用途是作为新型聚酯(如PTT)、聚醚和聚亚氨酯的单体，另外可用于生产溶剂、抗冻剂或保护剂等，具有广阔的应用前景［1］。1,3-丙二醇可通过化学法和生物法生产，生物法以其可利用可再生资源、对环境污染小而越来越受到人们的重视，各国都致力于研发生物技术合成1, 3-丙二醇［2］。

    克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）是微生物发酵生产1,3-丙二醇的菌种之一，在厌氧及好氧条件下均可利用甘油生长［3-5］。

    生物柴油是由动植物油脂转化得到的环保型可再生的清洁能源，目前世界许多国家都在推行使用，我国也在大力发展生物柴油产业［6，7］。在生产生物柴油的同时，可得到副产物粗甘油，随着生物柴油产量的增大，粗甘油的产量也迅速增加。

    本文通过批次发酵和流加补料发酵，对利用生物柴油副产物粗甘油发酵生产1,3-丙二醇的试验条件进行了研究，考察了不同生物柴油副产物粗甘油对克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae AC15）有氧发酵生产1,3-丙二醇的影响，为有效提高生物柴油副产物粗甘油原料的利用率，降低1,3-丙二醇生产成本，实现生物柴油和1,3-丙二醇联产提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种及甘油原料

    菌种：克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae AC15），清华大学应用化学研究所提供；精制甘油：北京益利精细化学品有限公司，纯度大于98%；粗甘油A：碱法生产生物柴油的副产物，美国Renewable Energy Group，纯度为83％，皂化值（KOH）12.1 mg/g；粗甘油B：生物酶法生产生物柴油的副产物，湖南海纳百川生物有限公司，纯度为78%，皂化值（KOH）13.2 mg/g；粗甘油C：碱法生产生物柴油的副产物，福建古杉生物柴油有限公司，纯度为68%，皂化值（KOH）16.5 mg/g。

1.2 培养基

    种子培养基组成见文献［8］。发酵培养基组成：甘油30 g/L，葡萄糖 5 g/L，K2HPO4 0.69 g/L，KH2PO4 0.25 g/L，(NH4)2SO4 4 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，酵母 1.5 g/L，微量元素1 mL/L，铁溶液1.2 mL/L。

1.3 1,3-丙二醇的发酵培养方法

1.3.1 种子培养 250 mL三角瓶9层纱布封口，装液量50 mL，接入斜面菌苔1环，摇床中进行好氧培养，培养温度37 ℃，时间12 h，摇床转速150 r/min。

1.3.2 发酵培养

1.3.2.1 批次发酵 250 mL三角瓶中装入100 mL发酵培养基（甘油初始质量浓度为30 g/L），接入斜面菌苔1环，在37 ℃、搅拌速度150 r/min条件下好氧发酵12 h。

1.3.2.2 流加补料发酵 在Braun Biostat B型5 L全自动发酵罐中进行，装液量4 L，接种量1%，搅拌速度300 r/min，发酵温度37 ℃，通气量0.5 vvm，用质量分数为40%的NaOH溶液控制pH 6.5, 发酵时间为48 h。流加补料发酵在发酵过程检测底物甘油的质量浓度，在甘油质量浓度降低到1~10 g/L的时候开始流加。试验用粗甘油和葡萄糖的混合液（甘油和葡萄糖质量浓度比为（2~6）∶ 1）控制发酵液中甘油质量浓度在10~40 g/L范围内。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量测定 生物量用650 nm的光密度(OD650)表示。菌体在722S分光光度计上于650 nm 处进行测定。

1.4.2 发酵产物组成的检测 使用高效液相色谱法(HPLC)测定。将发酵液用小型离心机于14 000 r/min下离心10 min，上清液用高纯水稀释20～100倍，即可进样测试。HPLC分析条件：Aminexsin-based 87H 色谱柱，柱温65 ℃；流动相为0.005 mol/L H2SO4，流速0.8 mL/min；检测器为CTO.10vp 折光示差检测器，温度65 ℃；进样量20 μL。

    发酵样品在上述色谱条件下，可获得如图1所示的高效液相色谱图，图中保留时间8.048、9.002、9.509、10.413、12.243、12.884、15.156 min分别为丁二酸(SUC)、乳酸(LAC)、甘油（GLY)、乙酸(ACE)、1,3-丙二醇（1，3-PD)、2,3-丁二醇(2,3-BD)和乙醇（ETH)。

图1 发酵样品高效液相色谱图

2 结果与分析

2.1 批次发酵试验

    以精制甘油和不同生物柴油副产物粗甘油为原料进行批次发酵，结果如表1所示。由表1可见，粗甘油与精制甘油发酵结果略有不同；精制甘油和粗甘油B为原料时，菌体OD650值相当，粗甘油A为原料时菌体OD650值较高，而粗甘油C为原料时菌体OD650值最小；对于1，3-丙二醇含量、转化率和生产强度，以精制甘油为原料时最高，粗甘油C为原料时最低；粗甘油B和粗甘油C为原料时发酵液中乳酸和乙酸含量较其他两种原料高；粗甘油B为原料时发酵液中2,3-丁二醇含量低；不同原料对发酵液中丁二酸和乙醇的含量影响不大。精制甘油、粗甘油A、粗甘油B及粗甘油C合成1,3-丙二醇的转化率和生产强度依次减小。

表1 不同甘油原料批次发酵试验结果

 注：q1,3-PD为1,3-丙二醇生产强度。

2.2 流加补料发酵试验

2.2.1 以精制甘油为原料的流加补料发酵试验 采用精制甘油为原料进行流加补料发酵试验,结果见图2。由图2可知，发酵48 h，发酵液中1, 3-丙二醇的含量最高，为68.39 g/L，此时1, 3-丙二醇转化率为51.45%，生产强度为1.43 g/ (L·h)。菌体OD650值在发酵前期增长迅速，在32 h达最大值10.90；发酵液中副产物乳酸终含量最高，为23.04 g/L，乳酸在发酵前期积累较慢，后期积累迅速，这与1, 3-丙二醇合成规律相反，从菌体代谢过程看，丙酮酸到乳酸是要消耗还原物质尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸－辅酶Ⅰ（NADH），而1, 3-丙二醇的合成也需要NADH的参与，这可能是两者之间存在负相关的内在原因［9］。发酵液中副产物2,3-丁二醇终含量仅次于乳酸，为22.83 g/L，乙酸在发酵前期积累，与1, 3-丙二醇呈正相关增长，后期略呈下降趋势；发酵液中乙醇缓慢增长。

图2 精制甘油流加补料发酵试验结果

2.2.2 以生物柴油副产物粗甘油A为原料的流加补料发酵试验 采用生物柴油副产物粗甘油A为原料进行流加补料发酵试验，结果见图3。由图3可知，发酵48 h，发酵液中1, 3-丙二醇最高含量达到60.54 g/L，此时1, 3-丙二醇的转化率为44.63%，生产强度为1.26 g/(L·h)。菌体OD650值在28 h达最大，为12.04，说明粗甘油A所含杂质对菌体的生长无不利影响；发酵液中乳酸最高含量为29.25 g/L， 2,3-丁二醇最高含量为25.3 g/L；发酵液中副产物乙酸含量是最低的。

图3 生物柴油副产物粗甘油A流加补料发酵试验结果

2.2.3 以生物柴油副产物粗甘油B为原料的流加补料发酵试验 采用生物柴油副产物粗甘油B为原料进行流加补料发酵试验，结果见图4。由图4可知，发酵48 h，发酵液中1, 3-丙二醇含量最高，为52.08 g/L,此时1, 3-丙二醇的转化率为41.27%，生产强度为1.09 g/(L·h)。菌体OD650值在36 h达最大，为9.86，较精制甘油为原料时小，生长也较精制甘油为原料时缓慢，说明粗甘油B所含的杂质对菌体的生长不利；发酵液中副产物乳酸最终含量为50.11 g/L， 2,3-丁二醇含量为15.5 g/L；乙酸在前期积累较精制甘油和粗甘油A为原料时快，后期下降趋势明显，最终含量较精制甘油和粗甘油A为原料时高。

图4 生物柴油副产物粗甘油B流加补料发酵试验结果

2.2.4 以生物柴油副产物粗甘油C为原料的流加补料发酵试验 采用生物柴油副产物粗甘油C为原料进行流加补料发酵试验，结果见图5。由图5可知，发酵48 h,发酵液中1, 3-丙二醇的含量最高，为44.43 g/L，此时1, 3-丙二醇的转化率为35.39%，生产强度为0.93 g/(L·h)。菌体OD650值增长缓慢，在36 h时达最大值9.1，且OD650最大值比精制甘油、粗甘油A、粗甘油B为原料时都小。原因可能是一方面由于粗甘油C纯度低、成分复杂，对菌体的生长有较大的抑制作用，另一方面粗甘油C中含有较多的皂类物质，加热容易结块所致。发酵液中副产物乳酸最终含量为39.8 g/L， 2,3-丁二醇含量为23.6 g/L；乙酸合成规律与粗甘油B为原料时相同，最终含量与粗甘油B为原料时相差不大。

图5 生物柴油副产物粗甘油C流加补料发酵试验结果

2.3 发酵生产1，3-丙二醇的经济效益对比

    对不同甘油原料流加补料发酵生产单位1, 3-丙二醇产品的经济效益进行粗略评估分析，原料单价通过市场调研和产品质量规律估价，分离收率经絮凝预处理［10］、反应萃取［11］、浓缩和精馏［12］提取纯化1, 3-丙二醇数据所得，忽略工艺过程中其他成本差异，仅对转化率和分离收率实验室数据进行简单放大，结果如表2所示。

表2 不同甘油原料生产1, 3-丙二醇的成本分析

    由表2可见，利用粗甘油A和粗甘油B发酵生产1, 3-丙二醇生产成本较低，与精制甘油相比，发酵生产单位1, 3-丙二醇的成本分别降低了37.4%和21.5%。而粗甘油C由于成分复杂，下游提取分离回收率低，总的生产成本比精制甘油高6.3%。所以利用生物柴油粗甘油发酵生产1，3-丙二醇需要考虑粗甘油原料的质量，粗甘油纯度太低和成分太复杂不适于发酵生产1，3-丙二醇。

    由此可见，利用廉价的生物柴油副产物粗甘油发酵可生产出高附加值的1, 3-丙二醇，同时在发酵过程中生成的丁二酸、乳酸、乙酸、2,3-丁二醇、乙醇也是用途广泛的化工产品。生物柴油粗甘油发酵生产1, 3-丙二醇工艺节省了粗甘油精制分离提纯的大量费用，经济效益更为可观。

3 结 论

    利用生物柴油副产物粗甘油发酵生产1, 3-丙二醇，从批次发酵试验结果可以看出，粗甘油纯度越高，皂化值越低， 1,3-丙二醇的转化率和生产强度也越高，生成副产物越少。流加补料发酵试验结果与批次发酵试验结果相吻合，但结果对比更加明显。经过对精制甘油和生物柴油副产物粗甘油发酵生产单位1, 3-丙二醇的经济效益进行粗略评估分析可以看出，利用生物柴油副产物粗甘油A和粗甘油B可大幅度降低生产成本，生物柴油副产物粗甘油C由于下游提取分离回收率低，反而增加了生产成本。由此可见，只要控制好生物柴油副产物粗甘油原料的质量，有效利用生物柴油副产物粗甘油耦合发酵生产1, 3-丙二醇，对生产生物柴油企业增值，进一步缩减生产1，3-丙二醇的生产成本具有十分重要的意义。

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