注射级大豆磷脂提取工艺的研究

注射级大豆磷脂提取工艺的研究

吕名蕊1，吕名秀2，蔡春明3，黄健花1，王兴国1

（1. 江南大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122； 2. 河南工程学院 材料与

化学工程系，郑州 450000； 3. 江苏省油脂产品质量监督检验中心，江苏 张家港 215600）

摘要：采用乙醇加热提取和冷冻纯化的方法，从大豆粉末磷脂提取PC含量在72%~85%，PE含量在5%~10%范围内的大豆磷脂产品。考察了乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间、冷冻温度、冷冻时间对产品得率和PC、PE含量的影响，在PC、PE含量符合要求的情况下以得率最高为优。结果表明理想提取工艺为乙醇体积分数95%，料液比1∶ 4，提取温度60 ℃，提取时间45 min，冷冻温度-15 ℃，冷冻时间30 min。在该条件下产品的得率为22.26%，PC含量为77.02%，PE含量为8.63%。

关键词：大豆磷脂；提取；乙醇；冷冻

中图分类号：TQ645;R97   文献标志码：A   文章编号：1003－7969(2010)09－0059－04

Extraction of soybean lecithin for injection

L Mingrui1, L Mingxiu2, CAI Chunming3, 

HUANG Jianhua1, WANG Xingguo1

(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, The State Key Laboratory of Food 

Science and Technology, Wuxi 214122, Jiangsu, China;2. Department of Materials and 

Chemical Engineering, Henan Institute of Engineering, Zhengzhou 450000, China;

3. Jiangsu Province Center of Supervision & Inspection on Oil and Fat Product Quality, 

Zhangjiagang 215600, Jiangsu,China)

Abstract：The soybean lecithin products with 72%-85% of phosphatidylcholine(PC) and 5%-10% of phosphatidyl ethanolamine(PE) were extracted from soybean phospholipids powder using hot-ethanol extraction and frozen purification method. The effects of ethanol concentration, the ratio of material to liquid, extraction temperature, extraction time, freezing temperature and freezing time on product yield, and the PC and PE content were investigated. High yield was expected, as well as the PC content and PE content of the product ranged from 72% to 85% and from 5% to 10%, respectively. The results showed that the best conditions were ethanol concentration 95%, the ratio of material to liquid 1∶ 4, extraction temperature 60 ℃, extraction time 45 min, freezing temperature -15 ℃, freezing time 30 min. Under the conditions, the product yield was 2226%, PC content was 77.02%, and PE content was 8.63%.

Key words：soybean phospholipid; extraction; ethanol;freezing

    磷脂是一种含磷的类脂物质，独特的双极性分子结构赋予其诸多特有的物化特性和生理活性，广泛应用于食品、医药行业，是制备各种药物制剂的乳化剂和辅料的理想原料［1］。

    磷脂中的主要组分磷脂酰胆碱(卵磷脂，PC)为亲水性磷脂，磷脂酰乙醇胺(脑磷脂，PE)为亲脂性磷脂［3,4］，PC/PE比例直接影响产品性能。目前，国内注射用磷脂以蛋黄卵磷脂为主，主要依赖进口。大豆磷脂作为植物来源的磷脂，较蛋黄磷脂具有脂肪和胆固醇含量低、成本低、乳化稳定性好，更适于作稳定的O/W型乳化剂等优点［2］。

    注射级磷脂的相关报道甚少，邵晓芬［1］、陆文达［5］等人对注射级磷脂的制备做了阐述，其产品质量指标均按《国家药品标准1998年》来进行。但是由于注射用磷脂尚无公认的通行标准，《中国药典》中未见关于注射级磷脂的要求，现行《国家药品标准1998年》中收载的注射用大豆磷脂的质量标准过于简单，对可能影响产品性能的指标PC和PE的比例未进行控制。导致目前注射级大豆磷脂产品仅处于研究阶段，实际应用终未有所突破。进口注册标准中明确规定注射用卵磷脂中PC和PE的限度为PC 72%~85%，PE 5%~10%［6］。因此，本文参考进口注册标准，根据PC易溶于乙醇，其他主要的磷脂组分如PE、磷脂酰肌醇(PI)在乙醇中溶解度较低［7］，在低温条件下非PC成分易结晶析出的原理，采用乙醇加热提取和冷冻纯化结合的方法从大豆粉末磷脂中提取大豆磷脂，控制其PC、PE含量在进口注册标准限度范围内，为进一步进行热原的脱除，制取注射级大豆磷脂提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

1.1.1 主要材料、试剂 大豆粉末磷脂（PC含量28.44%，PE含量25.93%），天津市博帅工贸有限公司；PC标准品(纯度≥99%)、PE标准品（纯度≥98%），美国Sigma公司；正己烷、异丙醇为色谱纯；无水乙醇、95%乙醇为分析纯。

1.1.2 主要试验仪器 高效液相色谱仪：美国Waters公司；Waters 2424型ELSD检测器；色谱柱：Waters Spherisorb Silica（4.6 mm×250 mm）；HAAKE D8循环制冷装置；RE-52A旋转蒸发仪；数显恒温水浴锅。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆磷脂的提纯［7,8］ 准确称取10.00 g大豆粉末磷脂，以一定的料液比加入一定体积分数的乙醇溶液，于一定温度加热搅拌一段时间，然后低温冷冻一定时间，取出后立即离心分离（5 min，4 000 r/min），取上清液于55 ℃旋转蒸发脱溶即得产品。

1.2.2 HPLC测定PC含量

1.2.2.1 色谱条件［9］ 色谱柱: Waters Spherisorb Silica (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A相(V(正己烷)∶ V(异丙醇)=6.5∶ 8)；B相(V(正己烷)∶ V(异丙醇)∶ V(水)=6.5∶ 8∶ 1.5)，进行梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；ELSD漂移管温度：70 ℃；雾化气：高纯氮；载气压力：3.0×10-5 Pa；光倍增管增益：5倍；进样量：10 μL。在本试验条件下，各峰的分离度符合规定。

1.2.2.2 标准溶液的配制 准确称取PC标准品19.1 mg，异丙醇溶解并定容至10 mL，得1.91 mg/mL的PC标准品储备液，冷藏备用。准确称取PE标准品9.6 mg，异丙醇溶解并定容至25 mL，得0.384 mg/mL的PE标准品储备液，冷藏备用。

1.2.2.3 标准曲线的绘制 分别准确量取上述PC标准品储备液适量，置于10 mL容量瓶中，配制成0.119、0.239、0.358、0.478、0.716、0.955 mg/mL的PC标准品溶液，按1.2.2.1方法逐个进样。以峰面积对质量浓度进行回归处理，得回归方程为：y=62 626 909x+7 981 495，R2=0.999 2；线性范围0119～0.955 mg/mL。

    分别准确量取上述PE标准品储备液适量，置于10 mL容量瓶中，配制成0.024、0.048、0.072、0096、0192、0.384 mg/mL的PE标准品溶液，按1.2.2.1方法逐个进样。以峰面积对质量浓度进行回归处理，得回归方程为：y=84 765 936x-189 475，R2=0.999 1；线性范围0.024～0.384 mg/mL。

1.2.2.4 样品的测定 准确称取一定量样品，异丙醇溶解并定容至10 mL，10 000 r/min离心10 min，按1.2.2.1色谱条件测定样品中PC和PE的含量。

2 结果与讨论

2.1 乙醇体积分数的影响

    利用PC和PE在乙醇溶液中溶解性的差异，采用不同体积分数的乙醇溶液提取磷脂，得到不同PC、PE组成的产物。在料液比1∶ 4、提取温度65 ℃、提取时间60 min、冷冻温度-15 ℃、冷冻时间60 min条件下，考察乙醇体积分数对得率和PC、PE含量的影响，结果见表1。

表1 乙醇体积分数对得率和PC、PE含量的影响

    由表1可知，乙醇体积分数不仅对产品得率有较大的影响，而且对产品的组成，即产品的PC、PE含量有较大的影响。显然，随着乙醇体积分数的下降，产品得率明显下降，这是由于水易冷冻结晶，随着乙醇体积分数的降低，体系水含量增加，则体系结晶沉淀增加；而水在结晶沉降的过程中将PC、PE同时沉淀，导致产品得率大大下降。就产品组成而言，仅当乙醇体积分数为95%时产品的PC含量、PE含量均在标准范围内；当体系不含水时，产物的PE含量过高；当乙醇体积分数小于95%时，产物PC含量过低。这是由于在水结晶沉淀的过程中，体系中的PC、PE随之析出，随着乙醇体积分数的降低，水结晶沉淀大量增加，带走大量的PC、PE，致使产物PC、PE含量降低。另一方面，随着水含量的增加，溶剂中的磷脂呈现出越来越严重的凝结现象，样品分散困难，试验操作性差，所以需严格控制水含量以保证提取效果。由上述试验可知，乙醇体积分数以95%为宜。

2.2 料液比的影响

    在乙醇体积分数95%、提取温度65 ℃、提取时间60 min、冷冻温度-15 ℃、冷冻时间60 min条件下，考察料液比（m（大豆粉末磷脂）∶ V(95%乙醇），下同）对得率和PC、PE含量的影响，结果见表2。

表2 料液比对得率和PC、PE含量的影响

    由表2可知，随着料液比的增加，得率明显提高；PC含量随乙醇比例的增加而降低，在料液比1∶ 6之后达不到标准要求；PE含量随乙醇比例的增加略微上升，在料液比1∶ 5之后过高，不符合标准要求。这可能是由于随着溶剂量的增加，非PC磷脂成分（包括PE）溶入的量增加，使得得率增加但PC含量相对降低。因此，综合考虑得率和PC、PE含量的要求，以料液比1∶ 4为宜。

2.3 提取温度的影响

    在乙醇体积分数95%、料液比1∶ 4、提取时间60 min、冷冻温度-15 ℃、冷冻时间60 min条件下，考察提取温度对得率和PC、PE含量的影响，结果见表3。 

表3 提取温度对得率和PC、PE含量的影响

    由表3可知，得率随着温度的升高而增加，当温度超过60 ℃后呈略微下降趋势。由于磷脂溶于溶剂中会结块，低温时黏度较大不利于分散均匀；温度过高产品易被氧化，也不利于提取，所以提取温度不能过高。随着温度的升高，PC含量略微上升，PE含量略微下降，但变化均不显著且均在标准范围内，由此可见，温度对产品组成的影响不显著。因此，该条件下主要考虑得率，确定最适提取温度为60 ℃。

2.4 提取时间的影响

    在乙醇体积分数95%、料液比1∶ 4、提取温度65 ℃、冷冻温度-15 ℃、冷冻时间60 min条件下，考察提取时间对得率和PC、PE含量的影响，结果见表4。

表4 提取时间对得率和PC、PE含量的影响

    由表4可知，随着提取时间的延长，得率先上升后略微下降。可能由于提取时间过短磷脂未能分散均匀；而时间过长产品发生氧化的几率增加，也不利于提取，所以提取时间不宜过长。随着提取时间的延长，PC、PE含量变化均不显著，均在标准范围内。因此，确定最适提取时间为45 min。

2.5 冷冻温度的影响

    在乙醇体积分数95%、料液比1∶ 4、提取温度65 ℃、提取时间60 min、冷冻时间60 min条件下，考察冷冻温度对得率和PC、PE含量的影响，结果见表5。

表5 冷冻温度对得率和PC、PE含量的影响

    由表5可知，随着冷冻温度的降低，得率明显下降；PC含量逐渐增加，在冷冻温度低于-15 ℃时符合标准要求；PE含量逐渐降低，冷冻温度低于-10 ℃时符合标准要求。这可能由于随着冷冻温度的降低，各组分结晶沉淀的更多，因此得率下降；而非PC成分（包括PE）更易结晶析出，使得PE含量下降，PC含量相对升高。因此，综合考虑得率和PC、PE含量，冷冻温度-15 ℃为宜。

2.6 冷冻时间的影响

    在乙醇体积分数95%、料液比1∶ 4、提取温度65 ℃、提取时间60 min、冷冻温度-15 ℃条件下，考察冷冻时间对得率和PC、PE含量的影响，结果见表6。 

表6 冷冻时间对得率和PC、PE含量的影响

    由表6可知，随冷冻时间的延长，得率明显下降；PC含量逐渐增加，PE含量逐渐降低，PC、PE含量均在冷冻时间长于30 min后符合标准要求。这可能由于冷冻时间过短不利于结晶，随着冷冻时间的延长，各组分结晶沉淀的更多，因此得率下降；而冷冻时间延长非PC成分（包括PE）结晶析出的更多，使得PE含量下降，PC含量相对升高。因此，综合考虑得率和PC、PE含量，冷冻时间30 min为宜。

2.7 乙醇加热提取和冷冻纯化最佳工艺条件验证试验

    在乙醇体积分数95%、料液比1∶ 4、提取温度60 ℃、提取时间45 min、冷冻温度-15 ℃、冷冻时间30 min条件下进行验证试验，产品得率为22.26%，PC含量为77.02%，PE含量为8.63%。验证试验的结果与预测结果接近，符合标准中注射用卵磷脂含量的要求，说明在上述条件下进行PC和PE组成合理的注射级磷脂的提取是可行的。

3 结 论

    以大豆粉末磷脂为原料，采用乙醇加热提取及冷冻纯化的方法提取大豆磷脂，使大豆磷脂组分符合参考的进口注册标准。考察了乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间、冷冻温度、冷冻时间对产品得率和PC、PE含量的影响，其中乙醇体积分数、料液比、冷冻温度、冷冻时间对得率和PC、PE含量均有显著影响；提取温度对得率影响较为显著，对PC、PE含量影响不大；提取时间对得率和PC、PE含量的影响最小。较理想的提取工艺为：乙醇体积分数95%，料液比1∶ 4，提取温度60 ℃，提取时间45 min，冷冻温度-15 ℃，冷冻时间30 min。此时，产品得率为22.26%，PC含量为77.02%，PE含量为863%。

参考文献：

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［9］ 吴惠爱, 麦小虹, 胡容融. HPLC - ELSD检测系统测定注射用卵磷脂主要组分的含量［J］. 广东药学院学报, 2003,19(3):228-291.·广告·    郑州颖辉食品化工有限公司