玉米秸秆水解液综合利用生产γ-聚谷氨酸

玉米秸秆水解液综合利用生产γ-聚谷氨酸

陈鹏程，任东雪，李佳涵，郑璞

     （江南大学 生物工程学院 ，工业微生物教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

摘要：以玉米秸秆预处理以及酶水解得到的还原糖作为碳源发酵产γ-聚谷氨酸(γ-PGA), 分别探究了葡萄糖、木糖、L-谷氨酸钠一水合物和金属离子对B. subtilis CGMCC 1250生长以及γ-PGA生产的影响，在摇瓶中优化培养基组分，并进行发酵罐放大操作。结果表明：玉米秸秆经过稀碱预处理以及复合酶水解后，得到的混合糖质量浓度为（76.3±5.7）g/L，其主要成分是葡萄糖和木糖，两者比例为2.19∶ 1;在配制发酵培养基时添加40 g/L的L-谷氨酸钠一水合物，及ZnSO4·7H2O 0.29 g/L、MnSO4·7H2O 0.05g/L、FeCl3·6H2O 0.11 g/L，摇瓶发酵可得到产量为（20.5±270）g/L的 γ-PGA ; 在3 L发酵罐实验中采用补料分批发酵的方式生产可以提高产物产量，得到产量为25.6 g/L的γ-PGA。

关键词：玉米秸秆水解液;葡萄糖;木糖;发酵; γ-聚谷氨酸

中图分类号：TQ922.1;TQ920.6文献标识码：A  文章编号：1003-7969（2018）11-0094-05

Integrated utilization of corn stover for poly (γ-glutamic acid) production

     CHEN Pengcheng, REN Dongxue, LI Jiahan, ZHENG Pu

     (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,

     Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

     Abstract：Corn stover was pretreated and enzymatically hydrolyzed into reducing sugar to produce polyγ-glutamic acid (γ-PGA) by fermentation. The effects of glucose, xylose, L-monosodium glutamate monohydrate and metal ion on the growth of B. subtilis CGMCC 1250 and γ-PGA production were studied, and the components of the fermentation medium were optimized and fermentation was conducted in a fermenter. The results showed that corn stover was pretreated by dilute base and enzymatically hydrolyzed by compound enzyme, and mass concentration of the reducing sugar was (76.3±5.7)g/L. The hydrolysate was mainly composed by glucose and xylose, with a ratio of 2.19∶ 1. Then 40 g/L of L-monosodium glutamate monohydrate, 0.29 g/L of ZnSO4·7H2O, 0.05g/L of MnSO4·7H2O and 0.11 g/L of FeCl3·6H2O were added into the initial fermentation medium, resulting into (20.5±2.70)g/L of γ-PGA. Finally, a fed-batch strategy was conducted in a 3 L fermenter to increase product yield, and 256 g/L of γ-PGA was achieved.

     Key words：corn stover hydrolysate; glucose; xylose; fermentation; poly(γ-glutamic acid)

     γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一种聚合物功能材料，其高吸水性、良好的生物相容性使其在农业、医药、食品、化妆品等诸多领域表现强劲[1]。在食品领域，γ-PGA可以与食品中油脂和脂肪酸结合形成抗氧化剂，避免油脂和脂肪酸在高温加工时遭到破坏；γ-PGA作为添加剂可以促进唾液分泌从而刺激味觉、增进食欲；γ-PGA还可以起到延缓食物变质的作用，将其添加到沙拉酱中能够增强牛乳的稳定性，延长其酸败变质时间；此外，γ-PGA 还对食物中的毒素有较好的抑制作用[2-6]。微生物生产γ-PGA的菌株主要是芽孢杆菌属的细菌，如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，最常见用于生产的碳源是六碳糖和柠檬酸[7-8]。为了适应不同行业对产品的需求，研究者仍然在不断寻找廉价可再生的原料以降低生产成本。我国是农业大国，玉米、水稻、小麦、甘蔗在我国种植面积广、产量高，每年产生大量的纤维素废弃物。传统的处理这些农业废弃物的方式有填埋、焚烧、作为堆肥，这些处理方式存在对环境的污染或成本较高，因此急需经济环保的处理农业废弃物的方式。将农业废弃物水解后产生的糖液作为碳源进行发酵生产目标产物是一个很好解决农业废弃物的方式，兼具经济性和环保价值。目前农业废弃物用于实际生产γ-PGA的例子还比较少，原因主要有木质纤维素降解成可利用糖的效率不高以及能利用木糖转化生产聚合物的细菌种类较少等。本研究考察了菌株B. subtilis CGMCC 1250以玉米秸秆水解液作为碳源发酵生产γ-PGA的可行性，通过稀碱预处理、复合酶水解得到富含葡萄糖和木糖的玉米秸秆水解液，分别探讨了葡萄糖和木糖对菌体生长和γ-PGA生产的影响，并证明了玉米秸秆水解液能够高效转化为产物，为工业化生产γ-PGA提供了一种廉价可再生原料。

     1材料与方法

     1.1实验材料 枯草芽孢杆菌(B. subtilis CGMCC 1250)，由浙江大学徐志南教授赠予，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)[9]。玉米秸秆产自于江苏连云港，晒干粉碎后过80目筛。纤维素酶购自山东泽生生物科技有限公司，木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶购自白银赛诺生物科技有限公司。种子培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，NaCl 5 g/L，木糖5 g/L，115 ℃灭菌20 min；发酵初始培养基：碳源60 g/L，蛋白胨40 g/L， L-谷氨酸钠一水合物40 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl21 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，115 ℃灭菌20 min。

     1.2实验方法

     1.2.1玉米秸秆的预处理和酶水解预处理：取过筛后的玉米秸秆按照1∶ 20的料液比加入质量分数1%的NaOH水溶液，灭菌锅121 ℃处理40 min，处理后300目纱布抽滤过滤，并水洗残渣至中性，70 ℃烘干备用。酶水解：称取2 g预处理后的干燥玉米秸秆于50 mL的醋酸钠缓冲溶液(50 mmol/L，pH 4.8)中，添加纤维素酶、木聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶，添加量分别为25、85、40 FPU/g（以底物干质量计，下同），于50 ℃摇床中180 r/min振荡反应一定时间。

     1.2.2发酵摇瓶发酵：取-40 ℃条件下的冷冻甘油管中的B.subtilis以体积分数1%的接种量接入种子培养基，于37 ℃摇床中110 r/min振荡培养12 h。按照体积分数10%的接种量将种子液装入250 mL锥形瓶中，发酵培养基装液量为30 mL，调节pH为7.0，于37 ℃摇床中200 r/min振荡培养48 h。发酵罐发酵：采用3 L发酵罐，装液量为1.5 L，115 ℃灭菌20 min。以体积分数6%的接种量接入种子液，发酵过程控制温度为37 ℃，通气量为2 L/min，转速为600~1 000 r/min。发酵过程中通过体积分数25%盐酸与体积分数50%氨水维持罐体的pH在7.0左右。在流加补料操作中，在糖质量浓度低于5 g/L时开启蠕动泵流加200 g/L的高质量浓度的糖溶液，流速设置为15~20 mL/h，使罐体中糖质量浓度保持在5~10 g/L。

     1.2.3检测分析以去离子水为空白对照，利用可见光分光光度计在波长600 nm处检测菌液的吸光值OD600来表征生物量。用高效液相色谱分析玉米秸秆水解液中还原糖的含量，色谱柱为Aminex HPX-87H型反相色谱柱（300 mm×7.8 mm，10 μm），流动相为3.3 mmol/L的H2SO4，流速0.5 mL/min，检测器温度35 ℃，柱温55 ℃。γ-PGA采用称重法检测，取5 mL发酵液12 000 r/min离心30 min除去菌体，取上清加入15 mL乙醇沉淀，在12 000 r/min转速下离心30 min，将沉淀置于60 ℃真空干燥箱烘干称重。

     2结果与分析

     2.1玉米秸秆的预处理对玉米秸秆水解效果的影响通过NERL法[10]测定玉米秸秆中纤维素含量为（38.0±5.6）%，半纤维素含量为（23.6±1.8）%，木质素含量为（16.5±2.3）%。预处理可以去除结晶纤维素，增加后期纤维素酶对于纤维素的可及性，降低纤维素的聚合度，去除木质素等。玉米秸秆用质量分数为1%的NaOH水溶液进行预处理后纤维素含量为（58.7±6.6）%，半纤维素含量为（33.6±25）%，木质素含量为（5.7±0.6）%，说明预处理后纤维素含量比较高，有利于后期用酶进行水解的过程。图1为预处理对玉米秸杆水解效果的影响。由图1可以看出，玉米秸秆经过预处理水解后的总糖质量浓度明显高于未预处理时的总糖质量浓度，在80 h时得到的总糖质量浓度为（76.3±5.7） g/L。总糖液中主要成分是葡萄糖和木糖，两者比例为2.19∶ 1，此外还有少量的阿拉伯糖。

图1预处理对玉米秸秆水解效果的影响

2.2葡萄糖和木糖对B. subtilis生长和γ-PGA产量的影响碳源是生物生长以及生产活动重要的能源物质。由于玉米秸秆水解液中主要含有葡萄糖和木糖，因此通过摇瓶实验分别研究这两种碳源对B. subtilis生长和γ-PGA产量的影响，结果如图2(a)和(b)所示。由图2(a)可以看出，发酵液生物量以及γ-PGA产量随着葡萄糖质量浓度的增加先增加后下降，当葡萄糖质量浓度为60 g/L时，生物量以及γ-PGA产量均达到最大值。木糖也可作为有效碳源为菌体生长和产物生成提供支持。由图2(b)可以看出，当木糖质量浓度为60 g/L时，γ-PGA产量最高；而质量浓度分别为80 g/L和100 g/L的木糖更有利于菌体生长，综合考虑生物量以及产物产量，木糖的最适质量浓度为40 g/L。比较这两种单糖对B. subtilis生长和γ -PGA产量的影响结果，可以看出，木糖更利于菌体生长，而葡萄糖能更有效地被B. subtilis利用生产γ-PGA。将发酵培养基中碳源质量浓度固定为60 g/L，使用不同葡萄糖和木糖浓度配比的模拟糖液作为碳源在摇瓶中发酵产γ-PGA，并与直接以玉米秸秆水解液作为碳源的结果相比较，结果如图2(c)所示。由图2(c)可以看出，使用混合糖液发酵得到的γ-PGA产量高于单一使用葡萄糖或者木糖，且葡萄糖含量的提高有利于产物生成。值得注意的是，使用玉米秸秆水解液发酵可得产量为（8.50±0.20）g/L的γ-PGA，这一数值与使用葡萄糖与木糖比例为2∶ 1的混合糖液得到的结果相当，证明了玉米秸秆水解液作为碳源发酵产γ-PGA的可行性。以下实验均以总糖质量浓度为60 g/L的玉米秸秆水解液作为碳源。由图2（c）还可以看出，使用玉米秸秆水解液发酵后的生物量低于直接使用葡萄糖与木糖比例为2∶ 1的混合糖液发酵得到的生物量，这可能是由于玉米秸秆水解液中除了葡萄糖和木糖，还存在一些醛类物质，这些物质会对菌体生长带来抑制作用。

图2葡萄糖(a)、木糖(b)及其配比(c)对生物量和γ-PGA产量的影响

2.3L-谷氨酸钠一水合物添加量和添加时间对B. subtilis生长和γ-PGA产量的影响由于B. subtilis CGMCC 1250是外源性谷氨酸依赖型菌株，主要利用外源谷氨酸合成γ-PGA，因此研究了L-谷氨酸钠一水合物添加量和添加时间对B. subtilis生长和γ-PGA产量的影响，结果如图3所示。

图3L-谷氨酸钠一水合物添加量(a)和添加时间(b)对B. subtilis生长和γ-PGA产量的影响

由图3(a)可以看出，L-谷氨酸钠一水合物添加量为40 g/L时可以获得γ-PGA最高产量，故选择40 g/L为最适添加量。值得一提的是在不添加外源谷氨酸时，仍然可以得到（8.50±0.20）g/L的γ-PGA，这说明可能存在来自碳源通过内循环合成的物质作为合成γ-PGA的前体[11]。由图3(b)可以看出，如果在配制培养基时直接添加L-谷氨酸钠一水合物，发酵后得到的γ-PGA产量最高，为（136±2.39）g/L，此时生物量也为最大；随着添加时间的推后，γ-PGA的产量呈现下降趋势。鉴于上述结果，在配制发酵培养基时直接添加40 g/L的L-谷氨酸钠一水合物。

     2.4金属离子对B. subtilis生长和γ-PGA产量的影响金属离子对聚谷氨酸合成酶及其他三羧酸循环的酶类有着重要影响，进而会影响菌体生长和γ-PGA合成。分别研究了添加Zn2+、Mn2+、Fe3+对菌体生长以及产物生成的影响，这3种离子均以水合盐的形式添加。结果如图4所示。图4(a)显示的是离子浓度均为0.5 mmol/L时得到的结果。由图4（a）可以看出，以上3种离子均对B. subtilis生长以及γ-PGA的生成有促进作用。接下来分别研究这3种离子浓度对B. subtilis生长和γ-PGA产量的影响。

图4金属离子对B. subtilis生长和γ-PGA产量的影响

由图4(b)可以看出，添加Zn2+可以使γ-PGA产量得到明显提高，Zn2+浓度在1.0 mmol/L时，γ-PGA产量高达（15.8±0.20 ）g/L；生物量随着Zn2+浓度的升高先呈现增大趋势，在Zn2+浓度为0.8 mmol/L时，生物量达到最大值，进一步增加Zn2+浓度会对菌体生长产生抑制作用。由图4（c）可以看出，Mn2+浓度为0.2 mmol/L时，γ-PGA产量达到最大值，为（12.3±0.15）g/L；Mn2+浓度超过0.4 mmol/L会抑制菌体生长，此时γ-PGA产量降低。由图4（d）可以看出，添加Fe3+可以显著提高生物量，生物量随着Fe3+浓度的升高呈现先增加后下降的趋势；Fe3+浓度为0.2、0.4 mmol/L时，γ-PGA产量增加，在0.4 mmol/L时，生物量和γ-PGA产量同时达到最大值。根据以上结果可知， Zn2+、Mn2+、Fe3+的最适浓度分别为1.0、0.2 mmol/L以及0.4 mmol/L，相对应的添加水合盐的质量浓度分别为ZnSO4·7H2O 0.29 g/L、MnSO4·7H2O 0.05 g/L、FeCl3·6H2O 011 g/L，并将这3种水合盐同时加入发酵培养基中，发酵可得γ-PGA产量为（20.5±2.70）g/L，较未添加时产量提高了50.7%。

     2.5玉米秸秆水解液生产γ-PGA的发酵罐放大研究 采用摇瓶优化的条件于3 L发酵罐中进行γ-PGA的生产，图5(a)为分批发酵结果。由图5(a)可以看出，前8 h菌体主要消耗葡萄糖实现快速增长，木糖几乎不被消耗；随后葡萄糖和木糖同时被消耗，γ-PGA产量持续增加，在24 h达到最大值183 g/L，此时葡萄糖几乎耗尽；24 h之后菌体利用木糖生长，生物量增长，但是γ-PGA产量开始下降，这可能由于γ-PGA是聚合物，胞外其他产物的累积会使其水解酶活力增加，从而降解γ-PGA供自己生长[12]。为了提高产物产量，在发酵液中葡萄糖质量浓度低于5 g/L时，采用流加高质量浓度玉米秸秆水解液的方式进行补料分批发酵，水解液糖质量浓度为200 g/L，发酵结果如图5(b)所示。由图5(b)可以看出，发酵进行到22 h时开始补料操作，可以看出补料操作提高了谷氨酸的利用率；22~34 h时葡萄糖质量浓度很低，这可能是由于加入的葡萄糖及时被利用；在30 h左右，生物量达到最大值；45 h左右停止流加，葡萄糖与木糖都保持一定的质量浓度；由于生物量下降，无法利用谷氨酸继续合成γ-PGA，产量在53 h时左右开始下降，在53 h获得最高γ-PGA产量，可达到25.6 g/L。

图5玉米秸秆水解液分批(a)和补料分批(b)发酵生产γ-PGA

3结论

本文考察了菌株B. subtilis CGMCC 1250以玉米秸秆水解液作为碳源发酵生产γ-PGA的可行性。玉米秸秆经过质量分数1%的稀碱预处理以及复合酶水解后，得到的水解液总糖质量浓度明显高于未处理时的总糖质量浓度，混合糖质量浓度为（76.3±5.7）g/L，主要成分是葡萄糖和木糖，两者比例2.19∶ 1。随后在摇瓶中优化了发酵培养基组分：碳源60 g/L，蛋白胨40 g/L，L-谷氨酸钠一水合物40 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl2 1 g/L，NaCl 10 g/L，ZnSO4·7H2O 0.29 g/L，MnSO4·7H2O 005 g/L，FeCl3·6H2O 0.11 g/L。摇瓶发酵可得产量为（20.5±2.70）g/L的 γ-PGA。最后在3 L发酵罐上进行γ-PGA的放大生产，采用补料分批发酵的方式可以提高产量，得到25.6 g/L的γ-PGA。

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