高酸值米糠油酶法酯化脱酸工艺研究

高酸值米糠油酶法酯化脱酸工艺研究

李 磊，单 良，金青哲，王兴国

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

摘要：采用油酸单甘酯作为酯化剂，对固定化脂肪酶Lipozyme RM IM催化高酸值米糠油酯化脱酸工艺进行了研究。确定的最佳工艺条件为：游离脂肪酸（FFA）与单甘酯（MG）摩尔比为2∶ 1，脂肪酶添加量4%(以底物总质量计），反应温度60 ℃。在最佳工艺条件下反应6 h，FFA含量由原来的19.75%降到1.83%，而TAG和DAG的含量分别增加了20.91%和7.08%。

关键词：米糠油；固定化脂肪酶；单甘酯；脱酸

中图分类号：TS2246;TQ641   文献标志码：A   文章编号：1003－7969(2010)10－0034－04

Deacidification of high-acid rice bran oil by lipase

catalyzed esterification

LI Lei,SHAN Liang,JIN Qingzhe,WANG Xingguo

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214222,Jiangsu,China)

Abstract：Oleic acid monoglyceride (MG) was used as the esterifying agent,and the deacidification technology of high-acid rice bran oil (RBO) was studied by immobilized lipase (Lipozyme RM IM) catalyzed esterification,and the conditions of the reaction were optimized as follows:molar ratio of free fatty acid (FFA) to MG 2∶ 1, lipase dosage 4% (based on the mass of total oil), temperature 60 ℃.After reaction for 6 h under the optimal conditions,the content of FFA was reduced from 1975% to 1.83%,and the TAG and DAG contents increased by 20.91% and 7.08%, respectively.

Key words：rice bran oil; immobilized lipase; monoglyceride; deacidification

    米糠油（Rice bran oil, RBO）的脂肪酸组成比较合理，其中含亚油酸37%，油酸43%［1］。经过多年的研究发现，米糠油中的油脂伴随物具有多种生理功效以及更好的加热稳定性［2］。但是，由于米糠中存在脂肪水解酶，使得米糠油中的游离脂肪酸（Free fat acid, FFA）含量较高，一般在10%以上，有些甚至在30%~40%之间，因此在采用传统的化学精炼工艺进行脱酸时导致油脂损失过高［3］。随着生物技术的发展，酶技术这种反应条件温和、催化效率高的新型工艺技术引起了相关学者的重视，并且在高酸值米糠油的脱酸过程中得到了初步应用［4］。甘油、单甘酯（Monoglyceride, MG）均可作为脱酸的酯化剂［5-7］，但是由于MG在油脂中的溶解性更好，使得在反应中的传质阻力小，因此更适合作为酯化剂进行脱酸。在可供油脂脱酸使用的脂肪酶中，常用的固定化脂肪酶有Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozymes 435，考虑到酯化过程中会产生一定数量的甘油二酯（Diacylglycerol , DAG），尤其是1,3－DAG，其具有防止动脉血栓形成、降低血脂、减少内脏脂肪积累等功能，所以利用1,3－位特异性脂肪酶Lipozyme RM IM催化酯化有利于产生更多的1,3－DAG，从而提高脱酸油的食用价值。

    本试验采用油酸单甘酯作为酯化剂，利用固定化脂肪酶催化高酸值米糠油酯化脱酸，对酯化反应工艺进行了初步优化。

1 材料与方法

11 主要试验材料、仪器

    米糠油：FFA含量为19.75%，购自上海地源油脂有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme RM IM（物理吸附大孔径阴离子交换树脂）：酯化活力为843.7 EU/g，由Novozymes公司提供；油酸单甘酯（纯度为81.2%），其主要脂肪酸组成为棕榈酸3.45%，油酸80.71%，亚油酸6.68%，硬脂酸3.45%，购自上海千为油脂有限公司；其余试剂均为分析纯。

    Waters 1525高效液相色谱系统，Waters Spherisorb Silica色谱柱（4.6mm×250 mm），Waters 2424型ELSD检测器，RE－52A旋转蒸发仪，循环水真空泵。

1.2 酯化方法

    将一定量的米糠油与油酸单甘酯共同置于圆底烧瓶中，加入一定量的固定化脂肪酶，在一定的温度和真空度为0.09 MPa 的旋转蒸发反应器中进行反应，转速为80 r/min。定时取样测定FFA含量。

1.3 FFA含量的测定

    按照GB/T 5530—2005《动植物油脂 酸值和酸度测定》。

1.4 甘油酯组成的测定［8］

    取一定量的甘油酯用正己烷溶解，然后经10 000 r/min离心后用于HPLC分析。HPLC分析条件：流动相A，V（正己烷）∶ V（异丙醇）=99∶ 1；流动相B，V（正己烷）∶ V（异丙醇）∶ V（冰乙酸）=1∶ 1∶ 0.01；流速1.0 mL/min，梯度洗脱，0 min、100%A，10 min、80%A，14 min、70%A，15 min、100%A，20 min、100%A。出峰顺序为TAG、FFA、1,3－DAG、1,2－DAG、1(3)－MG、2－MG。

2 结果与讨论

2.1 反应器的确定

    在高酸值米糠油脱酸反应中，反应器对脱酸效果的影响比较显著。本试验为了探索一个更高效的脱酸反应器，在反应温度60 ℃，反应时间6 h，加酶量4%（以反应底物总质量计，下同）条件下对3种反应器进行了筛选，结果见表1。

表1 不同反应器对脱酸效果的影响

 注：*表示添加10%的4分子筛作为携水剂。

    由表1可见，真空旋转蒸发仪的脱酸效果最好，其次是真空磁力搅拌器，最后是水浴振荡反应器。由于在水浴振荡反应器中脂肪酶会在重力作用下沉降，从而使酶与底物分散不均；同时酯化过程中产生的水分由于传质阻力较大而很难被分子筛所吸收，因此使得脱酸效果不好。在真空磁力搅拌器中由于转子的高速转动，与固定化脂肪酶颗粒发生碰撞从而导致固定化脂肪酶颗粒破碎；而在真空旋转蒸发仪上则无此现象。这主要是因为在真空旋转蒸发仪中反应物与固定化脂肪酶之间的混合是通过反应瓶自旋进行的，减少了转子对酶颗粒的破坏作用，在一定程度上延长了脂肪酶的使用寿命。因此，以下试验均在真空旋转蒸发仪中进行。

2.2 反应温度对脱酸效果及产物中各组分含量的影响

    温度对酶的稳定性、酶催化反应速率都有一定影响。温度升高，可以加速反应的进行，使反应时间缩短；但是反应温度一旦超出酶的最适反应温度，酶的催化活性中心构象就会发生不可逆的变化，从而使酶的催化活性降低甚至失活。因此，反应温度是酶促酯化反应过程中的一个重要因素。在FFA与MG摩尔比为2∶ 1，加酶量4%，反应时间6 h条件下，研究了反应温度对脱酸效果及产物中各组分含量的影响，结果见图1、图2。

图1 反应温度对脱酸效果的影响

注：反应时间6 h,MG未列出，下同。

图2 反应温度对产物中各组分含量的影响

    由图1可见，在30 ℃时，反应6 h FFA含量降低至10.18%，随着反应温度的升高FFA降低速率也逐渐增大，60 ℃时同样的反应时间FFA含量降低至2.37%，而80 ℃时相同的反应时间FFA含量仅降低至5.14%。这主要是因为温度过高，脂肪酶的活性中心构象发生变化，使得催化活性降低，因此对脱酸不利。从酶活性的角度考虑，选择60 ℃为最佳反应温度。在60 ℃下反应6 h米糠油的FFA含量由原来的19.75%降低到2.37%。而杨博等［5］人采用同样的脂肪酶、反应温度和反应时间，以甘油作为酯化剂进行的米糠油酯化脱酸操作仅能将酸值由1447%降低到7.5%左右。其主要原因可能是单甘酯与油脂有着更好的互溶性，使得脂肪酶在催化时能够更好地与FFA和MG接触。因此，MG比甘油更适合作为酯化剂。

    由图2可见，产物中TAG的含量随着反应温度的升高而增加,而1,3－DAG的含量随着温度的升高而减少。这可以用甘油酯的空间立体结构进行解释。甘油酯的合成路线是先由MG与FFA反应合成DAG，再生成TAG。由于MG的构架上有2个—OH，脂肪酸链所形成的空间位阻比较小，从而导致反应所需的能量较小，因此在较低的温度下生成较多的DAG。随着温度的升高，就有更多的能量克服空间位阻，所以可以生成更多的TAG。由图2还可以看出，产物中的DAG主要是1,3－DAG，这是由于固定化脂肪酶Lipozyme RM IM是1,3－位特异性脂肪酶，其催化生成的DAG主要是1,3－DAG。

23 加酶量对脱酸效果及产物中各组分含量的影响

    由于固定化脂肪酶的价格比较高，因此希望找到最佳的加酶量，以实现在相同的时间内既达到同样的效果又能够降低成本。在反应温度60 ℃，FFA与MG摩尔比为2∶ 1，反应时间6 h条件下，考察了固定化脂肪酶添加量对脱酸效果及产物中各组分含量的影响，结果见图3。

图3 加酶量对脱酸效果及产物中各组分含量的影响

    由图3可以看出，当加酶量从1%增加到4%时，FFA含量明显降低，当加酶量超过4%后，FFA含量的降低不是很明显，这主要是加酶量超出4%时，底物已被脂肪酶所饱和，多出的脂肪酶没法与FFA充分接触，达不到催化作用。因此，加酶量以4%为宜。

    由图3还可以看出，加酶量不同，产物组成也不同。随着加酶量的增加，TAG含量逐步增加，而1,3－DAG含量先增加后减少。这主要是因为当加酶量较低时，脂肪酶会被FFA与MG所饱和，生成的DAG很难再与脂肪酶接触，从而使得产物中的1，3－DAG含量较高，当加酶量较高时，MG会被一部分脂肪酶所饱和，剩余的脂肪酶可催化1,3－DAG与FFA反应生成TAG。由于1,3－DAG在生理学上有重要的作用［9］，因此可以通过选择合适的加酶量而生成1,3－DAG，从而提高米糠油的食用价值。

2.4 底物摩尔比对脱酸效果及产物中各组分含量的影响

    在反应温度60 ℃，加酶量4%条件下，考察FFA与MG的摩尔比对脱酸效果及产物中各组分含量的影响，结果见图4。

图4 底物摩尔比对脱酸效果及产物中各组分含量的影响

    从图4可以看出，当FFA与MG摩尔比为 05∶ 1时，反应6 h FFA含量降低至0.47%；当FFA与MG摩尔比为3∶ 1时，同样的反应时间FFA含量仅降低至3.98%，说明随着MG添加量的降低脱酸效果减弱。但是过多的MG添加量对脱酸效果也并没有太大的促进作用，相同的反应时间FFA含量差距也不是很大，而过多的MG残留会对油脂的食用性产生影响。

    当FFA与MG摩尔比为05∶ 1，即MG添加量较大时，生成的产物主要是DAG，尤其是1,3－DAG，与TAG的含量相差不大；随着FFA与MG摩尔比的增大，即随着MG添加量的降低，产物中1,3－DAG含量降低，TAG含量升高。这一点可以用脂肪酶催化合成甘油酯的反应机理来解释［10］。脂肪酶催化反应时首先是脂肪酶上的Se—OH基团攻击脂肪酸的—COOH形成脂肪酶－酰基复合体，同时有一分子的水释放出；然后脂肪酶-酰基复合体再与酰基受体偏甘油酯（或者是甘油）上的—OH结合，发生酰基转移而生成甘油酯，同时脂肪酶脱落而被释放。当MG添加量过多时，脂肪酶被MG饱和，生成的DAG很难与脂肪酶接近，也就不能生成TAG。随着MG的降低，FFA在底物中所占的比例升高，根据Lortie［11］的研究结果，FFA浓度升高会加速1,3－DAG向1,2－DAG的转化速度，因此最终产物中TAG含量会有所上升。由于DAG在生理学与生物学上有着特殊的功能性质［9,12］，也可以考虑添加合适的MG，使其生成的DAG含量升高，从而增加米糠油的食用价值。但是本试验从脱酸的效果、MG用量以及生成的甘油酯组成来考虑，还是宜采用FFA与MG摩尔比为2∶ 1。

    由图4可以看出，在FFA与MG摩尔比为2∶ 1，反应温度60 ℃，加酶量4%，反应6 h条件下，FFA含量由原来的1975%降至183%，产物中TAG和DAG含量分别增加了2091%和708%。

3 结 论

    本试验对固定化脂肪酶Lipozyme RM IM应用于米糠油脱酸的工艺进行研究。由于采用了MG作为酯化剂，脱酸效果好，脱酸反应时间短。同时研究了反应温度、加酶量、底物摩尔比等条件对脱酸效果的影响。确定了最佳反应工艺条件为：反应温度60 ℃，加酶量4%，底物摩尔比2∶ 1。在最佳反应条件下反应6 h后米糠油中FFA含量由原来的19.75%降至1.83%，产物中TAG和DAG含量分别增加了2091%和708%。

    脂肪酶催化脱酸具有良好的脱酸效果，而且与传统的脱酸方式相比，不仅不会产生对环境造成污染的废水，还能提高TAG含量。同时，采用MG作为酯化剂，可以使产物中的DAG含量也有明显的增加，改善了米糠油的食用价值，更符合人们健康用油的理念。

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