影响猪胰脂酶催化油茶籽油与亚油酸甲酯酯交换 过程中酯交换量和酰基位移因素的研究

影响猪胰脂酶催化油茶籽油与亚油酸甲酯酯交换

过程中酯交换量和酰基位移因素的研究

杨国龙1，王梦华1，王业涛1,2，付黎敏1

（1.河南工业大学 粮油食品学院, 郑州 450052； 2.嘉祥县嘉冠油脂化工有限公司, 山东 嘉祥 272400）

摘要：研究了无溶剂体系下猪胰脂酶催化油茶籽油与亚油酸甲酯酯交换反应过程中酯交换量和酰基位移的变化。结果显示，反应时间、酶的水活度、加酶量和反应温度对酯交换和酰基位移都有影响。加酶量和反应温度对酰基位移和酯交换量有直接影响，反应时间和酶的水活度通过影响酯交换速率来影响酰基位移。对猪胰脂酶来说，酯交换时酶的水活度在012~055之间，加酶量不大于10.0%，温度在40~45 ℃之间，控制合适的反应时间可使产物甘三酯的酰基交换程度较高（24%左右），酰基位移较小（小于5%）。

关键词：猪胰脂酶；酯交换；酯交换量；酰基位移

中图分类号：TQ641；O621.14   文献标志码：A   文章编号：1003－7969(2010)10－0038－04

Influence factors of acyl migration and incorporation degree during 

porcine pancreatic lipase catalyzed interesterification of 

oil-tea camellia seed oil and linoleic methyl ester

YANG Guolong1, WANG Menghua1, WANG Yetao1,2, Fu Limin1

(1. Faculty of Food Science and Engineering, Henan Univerisity of Technology, Zhengzhou 450052,

China； 2. Jiaguan Grease & Chemical Co., Ltd., Jiaxiang 272400, Shandong,China)

Key words：porcine pancreatic lipase; interesterification; incorporation degree; acyl migration 

    在利用猪胰脂酶等1,3-位专一性酶催化油脂改性时会存在副反应——酰基位移反应。酰基位移对酯交换反应产品质量的影响较大［1-3］,如果酰基位移不能得到有效控制，就较难得到预期的产品。

    反应时间、反应温度、底物比、水含量、脂肪酸种类和酶的添加量对酯交换量和酰基位移都有影响［4-7］。Yang等［4］人研究发现，程序控温可以有效遏制酶促酸解过程中酰基位移的产生，同时副产物较少。Vikbjerg等［5］人认为,适当降低反应温度、底物比和水的添加量都可减少酰基位移的发生。Carrin等［6］人研究发现，酶促酸解反应中酰基位移主要受底物比、反应温度和时间影响。

    本文研究无溶剂体系下猪胰脂酶催化油茶籽油和亚油酸甲酯进行酯交换，通过分析原料甘三酯和产物甘三酯的脂肪酸组成与分布，研究各反应因素对酯交换量和酰基位移的影响，为酯交换的研究提供一定的支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂

    亚油酸甲酯（纯度94.9%）、甲醇钠均为实验室自制；猪胰脂酶，购于Novozym公司；油茶籽油，河南信阳长园野生茶油有限公司,其脂肪酸组成及含量见表1。所用试剂中正己烷为色谱纯，其他均为分析纯。油茶籽油和亚油酸甲酯在使用前经5分子筛脱水48 h。

     表1 油茶籽油脂肪酸组成及含量 %

1.2 主要仪器、设备 

    Agilent 6890N型气相色谱分析仪，DF-101C型集热式恒温加热磁力搅拌器，800型低速离心机，ZF-I型三用紫外分析仪，电子天平（感量0.000 1 g），101A-3B型电热鼓风干燥器，薄层色谱（硅胶）板（20 cm×20 cm），展开槽等。

1.3 试验方法

1.3.1 酯交换反应过程 在（20±2） ℃的条件下，将猪胰脂酶与不同种类的饱和盐溶液在密闭容器中放置7 d来控制酶的水活度［8］（见表2）。在50 mL圆底烧瓶中加入一定量的油茶籽油和亚油酸甲酯，在搅拌条件下加热至设定温度，再加入一定量的猪胰脂酶，开始计时，在预定的时间停止反应，除去酶，而后对反应产物进行处理分析。

表2 20 ℃时不同饱和盐溶液控制的酶的水活度

1.3.2 产物甘三酯的全样脂肪酸组成分析［9］ 取一定量的反应产物于试管中，加入适量溶剂（正己烷）充分溶解，用点样器吸取一定量溶液点样于薄层色谱板上，展开后刮下甘三酯谱带，收集于10 mL离心管中进行甲酯化处理，取上层有机相用无水Na2SO4脱水、离心，上清液进行气相色谱分析。

1.3.3 产物甘三酯Sn-2位脂肪酸组成分析［9］ 取一定量的反应产物于试管中，加入适量溶剂充分溶解，用点样器吸取一定量溶液点样于薄层色谱板上，展开后刮下甘三酯谱带，收集于10 mL离心管中，加入20 mg猪胰脂酶及2 mL缓冲溶液（1 mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH 8），摇匀，再加入0.5 mL胆酸钠溶液（质量浓度为2 g/L）及0.2 mL氯化钙溶液（质量浓度为220 g/L），塞紧塞子，摇匀（约1 min）后置于（40.0±0.5） ℃的恒温水浴中保温1 min（缓慢摇动离心管），取出离心管，剧烈振荡2 min，在冷水中冷却离心管外部，加入1 mL盐酸溶液（浓度为1 mol/L)及1 mL乙醚于离心管中，塞紧塞子，于振荡器强烈振荡后，离心分层，用注射器抽取上清液，点样于薄层色谱板，展开后，刮下Sn-2位甘一酯谱带，进行甲酯化处理，气相色谱分析其脂肪酸组成。

1.3.4 气相色谱分析条件 仪器：Agilent 6890N气相色谱仪；检测器：氢火焰离子化检测器；色谱柱：HP-5，30.0 m×0.32 mm×0.50μm；进样口温度：230 ℃；柱温：210 ℃； 检测器温度：300 ℃；氮气流速：0.5 mL/min；氢气流速：35 mL/min；空气流速：400 mL/min。

1.3.5 酯交换量和Sn-2位酰基位移程度的评价方法 本试验选用油茶籽油和亚油酸甲酯进行反应，故用反应后甘三酯中亚油酸的增加量来表示酯交换程度的大小。即用酯交换量表示：

     酯交换量=L后-L前

式中：L前——反应前甘三酯中亚油酸的摩尔分数，即油茶籽油中亚油酸的摩尔分数；

    L后——反应后甘三酯中亚油酸的摩尔分数，即产物甘三酯中亚油酸的摩尔分数。

    用酯交换前后甘三酯Sn-2位脂肪酸含量的变化来表示酰基位移程度的大小。即用酰基位移表示：

    酰基位移=Oi－O0，式中Oi,O0分别为油酸在反应底物甘三酯和产物甘三酯中Sn-2位脂肪酸中所占的摩尔分数。

2 结果与讨论

    目前认为，脂肪酶催化油脂酯交换反应分两步完成，即水解反应和酯化反应，反应体系中甘二酯的浓度决定着目标产物甘三酯的生成速度。在专一性脂肪酶催化油脂酯交换过程中，水解反应之后会发生酯化反应也会发生酰基位移反应，即在1,3-位专一性脂肪酶催化作用下的底物油脂水解产生1,2-甘二酯、2,3-甘二酯和2-甘一酯等中间产物，这些物质不稳定，易发生酰基位移而生成1,3-甘二酯、1-甘一酯和3-甘一酯［10］。

2.1 反应时间对酯交换量与酰基位移的影响

    在油茶籽油与亚油酸甲酯摩尔比1∶ 3，猪胰脂酶与底物质量比1∶ 10，酶的水活度0.43，反应温度40 ℃条件下，酯交换量和酰基位移随反应时间的变化如图1所示。由图1可知，16 h之前，随反应时间的延长，酯交换量迅速上升（酯交换速率较大），酰基位移缓慢增加（酰基位移速率较小），此阶段酯交换反应占主导。 16 h以后，随反应时间的延长，酯交换量的增加相对缓慢（酯交换速率较小），酰基位移的增加相对较快（酰基位移速率较大）。酰基位移与酯交换同时进行，并且不可避免；但酯交换反应和酰基位移反应存在竞争关系，如果酯交换反应速率很快，酰基位移的速率就低。随反应时间延长，酯交换量增加，酰基位移程度也增加。选择合适的反应时间，既能保证一定的酯交换量又能将酰基位移控制在尽可能小的范围内，对于指导实际生产是非常必要的。

图1 酯交换量和酰基位移随反应时间的变化

2.2 酶的水活度对酯交换量与酰基位移的影响

    脂肪酶是在油-水界面上发挥催化作用的，水是维持脂肪酶活性的必要条件。由于反应物经5分子筛脱水处理后，反应体系的水活度是由酶的水活度决定的。酶促酯交换反应中，体系的水活度大小应该能够使酶保持具有反应活性的构象。反应体系中水活度过小会使酶活性受到影响；随着水活度的不断增大，酰基位移程度不断加深；水活度超过一定限度则水解反应程度较大，对酯交换反应不利。不同酶维持活性的水活度不尽相同［11］。

    在油茶籽油与亚油酸甲酯摩尔比1∶ 3 ，猪胰脂酶与底物质量比1∶ 10，反应时间20 h，反应温度40 ℃条件下，酯交换量和酰基位移随酶的水活度的变化如图2所示。由图2可知，酶的水活度在0.12~0.55之间变化时，酰基位移没有明显的变化，酯交换量有微小幅度降低；酶的水活度大于0.55时，酰基位移显著增高，酯交换量也呈明显下降趋势。相同时间内，酯交换量越大，说明酯交换速率也越大，则酰基位移程度相对较小；反之，酰基位移程度则较大。

图2 酯交换量和酰基位移随酶的水活度的变化

2.3 反应温度对酯交换量与酰基位移的影响

    在油茶籽油与亚油酸甲酯摩尔比1∶ 3，猪胰脂酶与底物质量比1∶ 10，酶的水活度0.23，反应时间20 h条件下，反应温度对酯交换量和酰基位移的影响如图 3所示。由图3可见，在40~45 ℃之间酰基位移较小，酯交换量基本不变；温度低于40 ℃时，酰基位移较大，酯交换量较低；温度高于45 ℃时酰基位移较大，酯交换量基本不变。温度较低时酶的活性也较低，酯交换速率较小；而温度较高时不但不能提高反应的酯交换量，相反酰基位移程度明显变大，这可能是因为反应温度的升高会使甘三酯的水解速度加快，反应体系中甘二酯的浓度增大，高温还有利于1,2-甘二酯、2,3-甘二酯向1,3-甘二酯转化，产生更多的酰基位移产物。

图3 反应温度对酯交换量和酰基位移的影响

2.4 加酶量对酯交换量与酰基位移的影响

    在油茶籽油与亚油酸甲酯摩尔比1∶ 3，酶的水活度0.23，反应时间20 h，反应温度40 ℃条件下，加酶量对酯交换量和酰基位移的影响如图4所示。由图4可知，酰基位移在加酶量小于10.0%时增加得较为缓慢，大于10.0%时增加得较为迅速；酯交换量在加酶量5.0%~15.0%之间随着加酶量的增加逐渐上升，加酶量大于15.0%后变化不大。这是因为在一定的酶浓度范围内，加酶量的增加使得反应底物与催化剂的接触机会增多，酯交换反应速率也增大，但是由于加酶量的增加使反应体系含水量增大，这在一定程度上促进了酰基位移程度的增大。随着加酶量的进一步增大，底物由未被酶饱和逐渐转为被酶所饱和，即并非全部酶同时参与反应，而是仅有一部分酶参加了酯交换反应，因此对酯交换量的影响较弱，但可以加快酰基位移的发生。

图4 加酶量对酯交换量和酰基位移的影响

3 结 论

    在猪胰脂酶催化油茶籽油与亚油酸甲酯进行酯交换反应过程中，反应时间、酶的水活度、加酶量和反应温度对酯交换量都有影响。加酶量和反应温度对酰基位移程度有直接影响，反应时间和酶的水活度通过影响酯交换速率影响酰基位移程度。对猪胰脂酶来说，酶的水活度在0.12~0.55之间，加酶量不大于10.0%，温度在40~45 ℃之间时，控制合适的反应时间（由酶的活性决定）可使产物甘三酯的酰基交换程度较高（24%左右），酰基位移较小（小于5%）。

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